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《寡核苷酸芯片技術(shù)雜交條件優(yōu)化研究》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。
1、山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院碩士學(xué)位論文寡核苷酸芯片技術(shù)雜交條件優(yōu)化研究姓名：潘繼紅申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：微生物與生化藥學(xué)指導(dǎo)教師：韓金祥200305012003屆碩士研究生學(xué)位論文寡核苷酸芯片技術(shù)雜交條件優(yōu)化研究摘要基因芯片是近年來(lái)在生命科學(xué)領(lǐng)域中迅速發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新技術(shù)。它具有高通量、微型化、自動(dòng)化和高度平行的特點(diǎn)，在許多領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用。該技術(shù)主要包括四個(gè)部分：DNA微陣列的制備、樣品制備與標(biāo)記、分子雜交與掃描、生物信息學(xué)分析。寡核苷酸芯片是根據(jù)反向雜交的原理，把事先設(shè)計(jì)并合成好的十幾至幾十個(gè)堿基的寡核苷酸探針通過點(diǎn)樣儀固定到玻片上，與熒光標(biāo)記的靶序
2、列在一定條件下雜交，經(jīng)洗滌后掃描檢測(cè)信息。雜交是芯片技術(shù)中最重要的一個(gè)環(huán)節(jié)。寡核苷酸芯片的雜交過程受許多因素的影響，如探針長(zhǎng)度、空間位阻、靶序列長(zhǎng)度、雜交溫度等。這些因素的影響是造成目前寡核苷酸芯片雜交重復(fù)性差的主要原因。重復(fù)性的好壞是寡核苷酸芯片應(yīng)用中人們所關(guān)注的重要問題。由于探針是通過共價(jià)鍵一端固定于玻片表面，雜交時(shí)只有標(biāo)記的靶序列可以自由移動(dòng)尋找互補(bǔ)的探針并與之雜交，因此靶序列和探針的結(jié)合有一定的空間位阻。為減少空間位阻，使雜交更易進(jìn)行，通常的方法是在探針的5’端連上一定長(zhǎng)度的臂作為spacer。Spacer的長(zhǎng)度不同、探針的長(zhǎng)度不同以及不
3、同大小的靶序列，雜交時(shí)的空間位阻有很大的區(qū)別，對(duì)雜交信號(hào)強(qiáng)度影響很大。因此為獲得靈敏、快速、重復(fù)性好的雜交結(jié)果，我們對(duì)雜交條件進(jìn)行了優(yōu)化，探討了不同spacer長(zhǎng)度、探針長(zhǎng)度、靶序列長(zhǎng)度對(duì)雜交信號(hào)和芯片雜交重復(fù)性的影響，優(yōu)化了雜交溫度和雜交時(shí)間。探討了由空白玻片自己處理成氨基玻片和醛基玻片的方法，以及采用PcR方法制各長(zhǎng)探針進(jìn)行較長(zhǎng)靶序列雜交檢測(cè)的方法。目的t探討寡核苷酸芯片探針固定化的方法，研究寡核苷酸芯片的重復(fù)性與Spacer和探針長(zhǎng)度之間的相關(guān)性，優(yōu)化雜交條件。探討由空白玻片自己處理成氨基玻片和醛基玻片的方法，以及采用PcR方法制備探針進(jìn)行
4、長(zhǎng)片段靶序列雜交檢測(cè)的方法。方法：設(shè)計(jì)spacer為poly(dT)Io～20的長(zhǎng)度為15～30的探針，與122～1067bp的熒光標(biāo)記靶序列雜交，雜交溫度選擇42～65℃，雜交時(shí)間選擇1～3h。第l頁(yè)2003屆碩士研究生學(xué)位論文寡核廿脧芯J{技術(shù)雜交條件優(yōu)化研究掃描分析雜交結(jié)果，通過Quantam．y定量分析軟件進(jìn)行定量。由空白玻片自己處理成氨基玻片和醛基玻片：PCR方法制備探針與長(zhǎng)片段靶序列進(jìn)行雜交檢測(cè)。結(jié)果：較短的如100bp左右的靶序列，spacer為p01y(dT)10、探針為20mer左右即可獲得非常理想的雜交結(jié)果。較長(zhǎng)的如750bp
5、左右的靶序列，較短的spacer不能獲得理想的雜交結(jié)果，可以選擇poly(dT)15或poly(dT)20。探針應(yīng)為20mer以上，25mer和30mer均能獲得較好的雜交結(jié)果。1k以上的靶序列與15～30mer的探針雜交信號(hào)較弱。隨探針長(zhǎng)度的延長(zhǎng)，雜交信號(hào)的變異系數(shù)逐步降低。15mer的探針雜交的信號(hào)較弱，雜交不夠穩(wěn)定，重復(fù)性也相對(duì)較差。20mer、25mer、30mer的探針的變異系數(shù)逐漸降低。spacer為15時(shí)變異系數(shù)最小。用由空白玻片處理得到的氨基玻片和醛基玻片可以獲得良好的雜交信號(hào)。PcR方法制備的長(zhǎng)探針與lk左右的長(zhǎng)靶序列有良好的雜
6、交結(jié)果。結(jié)論：通過優(yōu)化雜交條件可以有效地提高雜交效率。選擇spacer為poly(dT)15的25mer和30mer的探針可以獲得較好的重復(fù)性。由空白玻片處理得到的氨基玻片和醛基玻片可以代替購(gòu)買的氨基玻片用于實(shí)驗(yàn)，可以獲得理想的檢測(cè)結(jié)果，且成本低廉。對(duì)于500bp以下的較短的靶序列可以采用帶有較短的spacer如poly(dT)10～15和較短的如20～25mer探針即可獲得理想的雜交結(jié)果。而對(duì)于較長(zhǎng)的如750bp左右的靶序列，spacer為poly(dDl5探針長(zhǎng)度為25～30mer亦可獲得理想的雜交結(jié)果。對(duì)于lk左右的靶序列，采用短探針難以獲
7、得理想的穩(wěn)定的雜交結(jié)果，采用PcR方法制備的長(zhǎng)探針可以獲得較好的雜交結(jié)果。第2頁(yè)2003屆碩士研究生學(xué)位論文寡核廿艟芯片技術(shù)雜交條件優(yōu)化I{】f究AbstractBiochipisamicronuidicsystemforbiologicalanalysis，whichhasbeendeVelopedrapidlyinthefieldoflifescienceinrecentyears，ThegeDechjphasthecharacteristicofhighmroughput，minjature，automaticandh逗hlyparalle
8、landwecanfinditsapplicationinmanyfields．111istechn0109yismadeupoffou
