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《CHO-MBLw、CHO-MBLm52、CHO-MBLm54、CHO-MBLm57高表達株篩選及產(chǎn)物生物學特性研究》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學術(shù)論文-天天文庫。
1、碩士研究生：趙娜指導(dǎo)老師：陳政良摘要甘露聚糖結(jié)合凝集素(mannan．bindinglectin，MBL)是哺乳動物C型凝集素超級家族中膠凝素家族成員，主要由肝細胞分泌，作為糖蛋白存在于血漿中。MBL通過與2個MBL相關(guān)絲氨酸蛋白酶(MBLassociatedserineprotease，MASP．1，MASP．2)結(jié)合而激活補體凝集素途徑，在天然免疫中發(fā)揮重要作用?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)3個可導(dǎo)致血清(漿)MBL水平低下并進而引起調(diào)理吞噬缺損的MBL結(jié)構(gòu)基因點突變：CGT52TGT、GGC54GAC和GGA57GAA，其編碼產(chǎn)物的改變分別是Arg--->Cys、G
2、ly---}Asp及GlyjGlu。這些點突變?yōu)槌Ｈ旧w顯性遺傳，其基因頻率在不同種族人群中差異甚大，但總體來說極高，如第52位密碼突變在所研究過的人群中相對較低(≤0．1)，第54位密碼突變在歐亞人群中有較高頻率(0．11~o．14)，而第57位密碼突變在撒哈拉非洲人群中的頻率很高(O．23~0．29)。顯然，MBL缺損是迄今所發(fā)現(xiàn)的最常見的遺傳性免疫缺損病，而各種病原體的反復(fù)感染與MBL缺損密切相關(guān)。然而，MBL基因突變引起免疫缺損的機理迄今尚未完全清楚。本課題組曾將相同質(zhì)量數(shù)的野生型和3種突變型MBL真核表達載體用脂質(zhì)體法分別轉(zhuǎn)染入相同數(shù)目的CO
3、S7細胞中，72h后檢測各目的蛋白的分泌量。將4種(1種野生型基因轉(zhuǎn)染COS7和3種突變型基因轉(zhuǎn)染COS7)細胞培養(yǎng)上清中檢測出的蛋白進行One．wayANOVA分析，發(fā)現(xiàn)4種細胞培養(yǎng)上清中目的蛋白的量沒有顯著性差異(尸>0．05)，由此證明，MBL結(jié)構(gòu)基因點突變并不影響MBL蛋白的合成與分泌。既然MBL結(jié)構(gòu)基因點突變并不影響蛋白的合成與分泌，那是什么原因?qū)е露?、野生型和突變型MBL基因轉(zhuǎn)染CHO細胞穩(wěn)定高效表達株的篩選本課題組前期工作已成功構(gòu)建含有4種真核表達載體的CHO細胞，即CHO．MBLw、CHO．MBLm52、CHO．MBLm54和CHO．M
4、BLm57。將上述細胞分別復(fù)蘇后，在96孔板中單克隆化，待細胞克隆長至孔底的1／4后，挑取細胞株置12孔板內(nèi)培養(yǎng)24h后，以800mg／L的Zeocin加壓篩選。隨后的1個月中，每隔3～5天換液一次，維持Zeocin濃度為800mg／L。分別得到4、1、2、5株穩(wěn)定高效單克隆細胞株，ELISA檢測上清中目的蛋白濃度均達到1~2mg／L。RT-PCR分析表明，轉(zhuǎn)染4種MBL基因的CHO細胞均穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄mRNA。三、野生型和突變型MBL蛋白的純化及其生物學特性研究利用鼠抗人MBL．CRDmAb親和層析柱初步純化表達產(chǎn)物，Ni2+．NTAagarose層析柱進
5、一步純化表達產(chǎn)物，獲得野生型和突變型重組MBL蛋白。在lL培養(yǎng)上清中均獲得lmg左右的目的蛋白。經(jīng)Westernblot和ELISA鑒定，純Il碩士學位論文化后的蛋白產(chǎn)物可分別與抗MBL—CRD單克隆抗體、抗His單克隆抗體和抗MBL單克隆抗體結(jié)合。它們分別命名為野生型MBL蛋白和32Cys、34Asp、37Glu突變型MBL蛋白。通過SDS．PAGE和Westernblot分析，發(fā)現(xiàn)重組突變MBL蛋白以雙鏈(Mr約55000)為主，而重組野生型MBL分子則以二至六聚體(Mr150000--450000)為主。結(jié)果表明，突變蛋白的多聚化程度遠遠低于野生
6、型MBL蛋白。酵母菌凝集試驗顯示：人血漿天然MBL和野生型MBL蛋白能結(jié)合酵母菌細胞壁甘露聚糖，產(chǎn)生可見的凝集顆粒，3種突變型MBL蛋白凝集顆粒極少；配體結(jié)合實驗表明，只有天然MBL和重組野生型MBL蛋白才能與甘露聚糖有效結(jié)合，3種突變型MBL蛋白與糖結(jié)合的功能低下；補體C4d沉積試驗顯示，3種突變型MBL蛋白不能通過凝集素途徑激活補體系統(tǒng)。綜合上述資料及本室蔡學敏博士的MASPs結(jié)合試驗結(jié)果即3種突變型MBL蛋白與MASP．1、MASP．2的結(jié)合能力降低，我們認為，CGT52TGT、GGC54GAC和GGA57GAAMBL基因點突變引起的氨基酸殘基的
7、替換影響了其產(chǎn)物蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，使之不能形成結(jié)構(gòu)亞單位及其寡聚體，進而影響其功能，包括結(jié)合配體、MASPs的能力和激活補體凝集素途徑的活性。關(guān)鍵詞甘露聚糖結(jié)合凝集素基因點突變哺乳細胞表達生物學特性免疫缺損IIIlCellLinesofCHO—MBLw,CHO—MBLm52，CHO—MBLm54，CHO—MBLm57andResearchoftheBiologicalCharacteristicsofTheirProductsName：ZhaoNaSupervisor：ChenZhengliangABSTRACTMannan—bindinglectin(M
8、BL)，amemberofthecollectinsuperfamily(C-typelect
