基于一維DNA組裝磁性納米探針的夾心型安培免疫傳感器研究

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1、第39卷分析化學(xué)(FENXIHUAXUE)研究報告第l1期2011年11月ChineseJournalofAnalyticalChemistryl634～1640基于一維DNA組裝磁性納米探針的夾心型安培免疫傳感器研究巫遠(yuǎn)招干寧¨胡富陶李天華曹玉廷鄭磊(寧波大學(xué)新型功能材料及其制備科學(xué)國家重點實驗室基地，材化學(xué)院，寧波315211)(南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院檢驗科，廣州410003)摘要采用FeO(核)／ZrO(殼)納米磁珠(ZMPs)標(biāo)記待測物識別抗體，并用HRP酶封閉和DNA鏈接，建立了一類新型的“珠鏈狀”一維磁性納米探針制備方法。將甲胎蛋白(AFP)一抗固定于納米金修飾的

2、玻碳電極表面，構(gòu)建了免疫電極(GCElAFPAb。)?；谠撾姌O和上述合成探針，通過雙抗體夾心法測定免疫產(chǎn)物上HRP酶對過氧化脲(cP)氧化對苯二酚反應(yīng)的催化電流，研制了一類基于一維納米結(jié)構(gòu)組裝的夾心型安培免疫傳感器。研究表明：此一維納米結(jié)構(gòu)探針不僅大大增加了酶在電極表面的富集量，成倍擴增了催化電流，顯著提高了傳感器的靈敏度，而且易于通過外磁場與背景液可控分離，簡化了分析步驟，并提高了結(jié)果的重復(fù)性。此傳感器對AFP檢測的線性范圍為O．O1～25g／L；檢出限達(dá)4ng／L(3a)，并被用于人血清中痕量AFP的測定，結(jié)果滿意。關(guān)鍵詞脫氧核糖核酸；FeO／ZrO；一維磁性納米探針

3、；甲胎蛋白；夾心型安培免疫傳感器1引言甲胎蛋白(AFP)含量升高往往預(yù)示著癌癥發(fā)生，故在臨床上普遍作為診斷惡性腫瘤的有效指標(biāo)_1]。AFP的常規(guī)檢測主要采用放射免疫法(RIA)、酶聯(lián)免疫法(ELIsA)、熒光免疫法(FIA)和時間分辨熒光免疫法等。上述方法具有準(zhǔn)確、高效等特點，但是步驟繁瑣耗時、血樣用量大、儀器龐大昂貴，無法滿足人員流動性強的用血單位(如血站、口岸)對AFP現(xiàn)場快速檢測的要求。因此，有必要開發(fā)高靈敏、樣品用量小的便攜式AFP免疫分析方法。電化學(xué)免疫法將具有高靈敏度的電化學(xué)測定技術(shù)與高特異性的免疫反應(yīng)結(jié)合，相對于傳統(tǒng)的ELISA法，具有響應(yīng)快、靈敏度高、樣品用

4、量小等特點，是當(dāng)前臨床生化檢驗研究的熱點之一[2]。近年來，基于酶聯(lián)免疫分析原理開發(fā)了夾心型安培免疫傳感器，通過雙抗體同時識別抗原生成“三明治”型產(chǎn)物，利用二抗探針表面負(fù)載酶(如}Ⅱ)催化特定底物的電化學(xué)反應(yīng)，基于產(chǎn)生的催化電流進(jìn)行定量分析。該類傳感器檢測靈敏度和特異性較“基于一步免疫分析”原理的傳感器顯著提高]。構(gòu)建高靈敏的該類傳感器關(guān)鍵是簡易合成具有較高酶標(biāo)記密度的探針，以放大檢測信號。目前，在探針表面固定抗體的常用方法，如物理吸附、共價結(jié)合以及凝膠包埋等，存在牢固度差、繁瑣耗時、生物活性下降等不足。ZrO作為一種Lewis強酸，通過與蛋白分子上的羧酸『8o]和DNA上

5、的磷酸l1。。等基團(tuán)(Lewis強堿)特異性取向結(jié)合，可被直接用于固定酶及抗體。由于抗體和酶包被在極細(xì)(1～2um)且表面積很大的納米ZrO上，標(biāo)記量顯著增加，且能較長時間地保持生物活性[1。DNA和ZrO。結(jié)合牢固并具有特異性l7]。但是如采用DNA直接固定ZrO。制作探針，由于與游離抗體同時存在于懸濁液中，彼此很難分離?；诩{米鐵磁性氧化物(如Fe0)材料構(gòu)建磁性納米探針，并在外磁場作用下可控分離結(jié)合探針與游離抗體的方法，具有方便、簡單、快速、徹底等特點。本課題組合成了Fe0(核)／ZrO(殼)磁性納米材料(簡稱zMPs)_l，適于構(gòu)建該類磁性探針。由于夾心免疫傳感器的

6、電流響應(yīng)和探針表面標(biāo)記酶濃度呈正比；而DNA作為一維長鏈分子含有大量的磷酸基團(tuán)，可固定多個HRP酶聯(lián)AFP抗體(zMPs—HRP—AFPAb)磁珠，進(jìn)而提高探針表面HRP酶標(biāo)記量，因此可顯著擴增201卜02-08收稿；201卜05—2O接受本文系國家自然科學(xué)青年基金(No．20805024)。廣東省科技計劃項目(Nos．2010A0303000006，2008A050200006)和寧波大學(xué)王寬誠基金資助項目E-mail：ganning@nbu．edu．cn；nflab@126．corn第11期巫遠(yuǎn)招等：基于一維DNA組裝磁性納米探針的夾心型安培免疫傳感器研究電流響應(yīng)。本研

7、究通過DNA連接多個ZMPs—HRP—AFPAb：納米磁珠，采用外磁場分離后，制備了具有較高酶標(biāo)記密度的一維磁性納米結(jié)構(gòu)探針(DNA／(ZMPs—HRP—AFPAb：))；基于納米金修飾的玻碳電極固定AFP一抗(GCEfAFPAb。)作為免疫電極，構(gòu)建一維磁性納米組裝的夾心型安培免疫傳感器，用于AFP的測定。2實驗部分2．1儀器與試劑CHI一660B電化學(xué)分析工作站(上海辰華儀器公司)；三電極體系：玻碳修飾電極(GCE，直徑2mm)為工作電極，鉑電極為對電極，飽和甘汞電極(SCE)為參比電極；1-1-7650型透射