廣西三黃雞抗馬立克氏病相關(guān)基因篩選的研究

《廣西三黃雞抗馬立克氏病相關(guān)基因篩選的研究》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。

1、廣西大掌硬士掌位論文廣蕾r三，

2、雞抗馬立克景Jt相關(guān)

3、i日姊葺l的研究廣西三黃雞抗馬立克氏病相關(guān)基因篩選的研究摘要馬立克氏病(MD)是雞的一種淋巴組織增生性疾病，對家禽業(yè)危害極大。開展廣西三黃雞抗MD相關(guān)基因篩選的研究，旨在確立相應(yīng)的分子遺傳學(xué)標(biāo)記來促進(jìn)三黃雞的抗MD育種工作，以彌補(bǔ)傳統(tǒng)的疫苗接種為主的MD防制手段的不足。至此，已完成如下工作：應(yīng)用廣西MDV-1強(qiáng)毒分離株YL040920／C6對7日齡46羽普通霞煙雞(分兩組：A組未免疫，24羽、B組1日齡免疫HVT，22羽)和53羽MD抗性雞(分兩組：C組未免疫，27羽、D組1日齡

4、免疫HVT，26羽)分別進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，按常規(guī)分開隔離飼養(yǎng)，觀察和記錄雞的死亡情況，至攻毒后(PC)12周結(jié)束試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，A、B、C、D四組的腫瘤死亡率分別為66．67％、63．63％、44．44％和42．31％，腫瘤發(fā)生率分別為75．00％、72．72％、48．14％和46．15％，經(jīng)t檢驗(yàn)表明，MD抗性雞的腫瘤死亡率顯著低于普通霞煙雞(P0．05)；對不同臟器腫瘤發(fā)生率的統(tǒng)計(jì)表明，心臟腫瘤發(fā)生率最高(43．5％)

5、，肝臟腫瘤次之(29％)，皮膚腫瘤再次之(10．6％)；采用血凝抑制(m)試驗(yàn)測定試驗(yàn)雞血清雞新城疫(ND)和禽流感(AI)抗體的效價(jià)，結(jié)果表明經(jīng)過多次ND和舢疫苗免疫后，雞體ND和赳抗體滴度一直沒能達(dá)到預(yù)期水平，表明MDV感染霞煙雞后產(chǎn)生了一定的免疫抑制作用。攻毒前后共計(jì)五次無菌采集并分離雞外周血淋巴白細(xì)胞(PBLs)，置于-80℃保存，為下一步研究準(zhǔn)備材料。利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)分析的方法，對MDV攻毒后抗性存在差異的112份霞煙雞PBLs生長激素基因第四內(nèi)含子(Gill)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

6、，采用限制性內(nèi)切酶SacI和Msp1分別進(jìn)行限制-性片段長度多態(tài)·陛檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅有1個(gè)SacI酶切位點(diǎn)存在于Gill上，不具備多態(tài)性，而在GHl上存在2個(gè)MspI酶切位點(diǎn)，形成6種基因型分別為：AA、AB、AC、BB、BC和CC。ME)抗性雞中AA型所占比例最高(50％)，BB、CC型為(O％)，在普通霞煙雞中BB、CC型分別為(9．26％和1．85％)。經(jīng)過卡方獨(dú)立性檢驗(yàn)表明，6種基因型在MD抗。陛雞和普通霞煙雞中的分布差異并不顯著(P<0．05)。MD抗性雞基因純合廣西大尊啊IE士掣啦論文．I-．-圈+三，}雞抗馬j-J‘最

7、庸相關(guān)

8、i囡嬸嗣}的習(xí)F兜度高于普通霞煙雞，在雜合度、有效等位基因數(shù)及多態(tài)信息含量遺傳指標(biāo)上均低于普通霞煙雞，說明了我們培育的MD抗性雞在種群上經(jīng)過了15年后仍保持了較好的遺傳穩(wěn)定性。用建立的逆轉(zhuǎn)錄酶一聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT．PCR)技術(shù)對MD抗性存在差異的霞煙雞個(gè)體(其中MD抗性雞11羽，代號分別為K7、K13、K16、Y30、A3、C12、C13、C22、D2、D16；易感雞3羽，代號分別為A22、Y12、Y25)分別進(jìn)行B．Fala2基因的擴(kuò)增并測定其核苷酸序列，對所獲得的序列在GeneBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST分析與比較。結(jié)

9、果發(fā)現(xiàn)，抗性個(gè)體D2、D16核苷酸序列結(jié)果與B2MD中等抗性的單倍型的同源性分別高達(dá)98．7％和99．4％；抗性個(gè)體C22、K16、Y30三者間序列的同源性也分別高達(dá)99．2％、99．O％、99．8％，基于同一單倍型具有相同或相似的B-Fal以基因序列這一觀點(diǎn)，可以認(rèn)為MD抗性雞D2、D16與C22、K16、Y30可能分別屬于兩個(gè)具有MD抗性的單倍型。14羽MD抗性差異雞的B-Fala2基因核苷酸同源性在91％～99．8％，說明此基因區(qū)域堿基替代還是非常頻繁，呈現(xiàn)出豐富的多態(tài)性。另外，本次實(shí)驗(yàn)中所測定的14羽霞煙雞B-Fala2基因

10、均屬于四．FⅣ類等位基因。應(yīng)用建立的逆轉(zhuǎn)錄酶～聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)技術(shù)對霞煙雞B．Fa2a3基因進(jìn)行體外擴(kuò)增，對目的基因進(jìn)行TA克隆，經(jīng)HindIII、EcoRI雙酶切和測序鑒定后，將目的基因片段成功定向亞克隆于pSP72質(zhì)粒T7啟動子下游的多克隆位點(diǎn)，經(jīng)過PCR和HindIII、EcoRI雙酶切鑒定，采用HindIII單酶切rpSP72-B．Fa2a3重組質(zhì)粒得到線性化轉(zhuǎn)錄模板DNA，在體外以T7RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄合成，成功制備了用于進(jìn)行核糖核酸酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)(Ⅺ)A)的B-Fa2a3反義RNA探針；采用核糖核酸酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)技術(shù)

11、對MD抗性與普通霞煙雞進(jìn)行B-Fa2a3基因的mRNA定量表達(dá)測定，結(jié)果顯示MD抗-陛雞的B-Fa2a3基因表達(dá)水平比普通霞煙雞表達(dá)低。本研究的結(jié)果表明，m抗性雞與易感雞在B-Fa2a3基因的表達(dá)上存在明顯差異，從而可以初步的把B-F