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1、南京建成生物工程研究所僅用于科研、實驗室細胞凋亡線粒體膜電位檢測試劑盒一、試劑盒說明：大量的研究表明線粒體與細胞凋亡密切相關(guān)，其中線粒體跨膜電位（△ψ）的破壞，被認為是細胞凋亡級聯(lián)反應過程中最早發(fā)生的事件之一，它發(fā)生在細胞核凋亡特征（染色質(zhì)濃縮、DNA斷裂）出現(xiàn)之前，一旦線粒體跨膜電位崩潰，則細胞凋亡不可逆轉(zhuǎn)。本試劑盒采用JC-1(5,5’,6,6-tetrachloro-1,1’,3,3-tetraethylbenzimidazolcarbocy-anineiodide)一種陽離子脂質(zhì)熒光染料作為檢測線粒體跨膜電位指示劑。JC-1有單體和多聚體兩種存在狀態(tài)，在低濃度時以單體的形式存在，高
2、濃度時以多聚體形式存在，兩者的發(fā)射光譜不同，但均可在流式細胞儀綠色（FL-1）通道檢測出綠色熒光，JC-1可透過正常細胞膜以單體狀態(tài)聚集胞內(nèi)，正常健康線粒體的膜電位（△ψ）具有極性，JC-1依賴于△ψ的極性被迅速攝入線粒體內(nèi)，并因濃度增高而在線粒體內(nèi)形成多聚體，多聚體發(fā)射光為紅色熒光；可被流式細胞儀的紅色（FL-2）通道檢測到，而細胞發(fā)生凋亡時，線粒體跨膜電位被去極化，JC-1從線粒體內(nèi)釋放，紅光強度減弱，以單體的形式存在于胞質(zhì)內(nèi)發(fā)綠色熒光。根椐這一特征檢測線粒體膜電位的變化。本試劑盒可應用于細胞、組織或純化的線粒體膜電位檢測。二、試劑盒組成與配制：組分10assays20assaysJC
3、-110μl20μl10×IncubationBuffer2.0ml4.0ml三、試劑盒以外自備儀器和試劑：流式細胞儀或熒光顯微鏡、高速離心機、CO2培養(yǎng)箱、微量移液器1.5mLMicrotube、載玻片、蓋玻片（熒光顯微鏡觀察需用）、PBS、滅菌去離子水四、使用注意事項1．微量試劑取用前請離心集液。2．JC-1避光保存及使用。63．細胞培養(yǎng)的數(shù)量不宜超過1×10，否則細胞會產(chǎn)生自然凋亡影響檢測。4．對PH變化過于敏感的細胞建議用胎牛血清取代Buffer孵育染色及洗滌，或延長觀測時間。南京建成生物工程研究所僅用于科研、實驗室5．流式細胞儀檢測線粒體膜電位變化受到多種因素的影響，因誘導劑、細
4、胞株類型，作用時間的不同而熒光強度比例都有不同，因此沒有通用標準的補償設(shè)門指南，因此每個試驗需設(shè)陰性及陽性對照組進行熒光補償及設(shè)門。6．組織需先制備單細胞懸液或提取純化線粒體后方可進行檢測，可選用細胞懸液制備試劑盒或線粒體提取試劑盒。五、操作方法1．用適當?shù)姆椒ㄕT導細胞凋亡，同時設(shè)立陰性對照組和陽性對照組【用適當?shù)牡蛲稣T導劑（如星形孢菌素，staurosporine），誘導適當時間后經(jīng)其它檢測（如AnnexinV或Caspase3活性）證實確有凋亡產(chǎn)生】，收集細胞；62．用PBS洗滌細胞二次（離心2000rpm，5min），收集不多于1×10的細胞；3．取100μL10×Incubatio
5、nBuffer加900μL滅菌去離子水稀釋成1×IncubationBuffer，混勻并預熱至37℃；4．吸取500μL1×IncubationBuffer，加入1μLJC-1，渦旋混勻配成JC-1工作液；【因JC-1在水中的溶解度很小，所以可以通過離心的方法（10，000rpm，1min）去除不溶的顆粒，吸取離心后的上清使用，以消除干擾】5．取500μLJC-1工作液將細胞均勻懸浮，37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育15~20min；6．室溫離心（2000rpm，5min）收集細胞，用1×IncubationBuffer洗兩次；7．吸取500μL1×IncubationBuffer重新懸浮
6、細胞；8．熒光顯微鏡觀察或流式細胞儀分析。A．熒光顯微鏡觀察1．滴一滴上述細胞懸液于載玻片，蓋上蓋玻片，于熒光顯微鏡下觀察；2．對于貼壁細胞來說，也可直接用蓋玻片來培養(yǎng)細胞并誘導細胞凋亡；用PBS洗滌細胞兩次；滴加100μLJC-1工作液，加蓋玻片，37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育15~20min；1×IncubationBuffe洗滌1~2遍；將蓋玻片倒置于載玻片上，于熒光顯微鏡下觀察；正常細胞：雙色濾光片觀察則為：綠++紅++（高綠高紅），如在同一濾光片下觀察則為黃綠色凋亡細胞：雙色濾光片觀察則為：綠++紅+（高綠低紅），如在同一濾光片下觀察則為綠色B．流式細胞儀分析用流式細胞儀檢測（
7、Ex=488nm;Em=530nm）細胞凋亡的情況，綠色熒光通過FITC通道通常為FL1來檢測；紅色熒光通過PI通道通常為FL2來檢測。.正常細胞{FL-1亮,FL-2亮;R1}，凋亡細胞{FL-1亮,FL-2暗;R2}，設(shè)門的位置根椐細胞種類、實驗條件等不同而變化，試驗需設(shè)未經(jīng)處理的正常細胞為陰性對照組和陽性對照組，根椐陰性和陽性對照組的雙參數(shù)散點圖來設(shè)定門的位置。南京建成生物工程研究所僅用于科研、實驗室六、實驗舉例：
