《蛋白互作研究方法》PPT課件

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1、蛋白質(zhì)相互作用研究方法王心宇CollegeofLifeSciences1研究蛋白質(zhì)相互作用的意義隨著生命現(xiàn)象的研究逐漸由獲取基因序列信息轉(zhuǎn)向研究基因功能,一門新的學(xué)科———蛋白質(zhì)組學(xué)proteomics應(yīng)運(yùn)而生。蛋白質(zhì)組是一個(gè)在空間和時(shí)間上動(dòng)態(tài)變化的整體,其功能往往是通過(guò)蛋白質(zhì)之間或與核酸之間相互作用而表現(xiàn)出來(lái)的,這種相互作用存在于機(jī)體每個(gè)細(xì)胞的生命活動(dòng)過(guò)程中,相互交叉形成網(wǎng)絡(luò),構(gòu)成細(xì)胞中一系列重要生理活動(dòng)的基礎(chǔ)。因此,對(duì)于蛋白質(zhì)相互作用interactome的研究就成為蛋白質(zhì)組學(xué)中最主要研究?jī)?nèi)容之一。2蛋白質(zhì)相

2、互作用常用研究方法1酵母雙雜交(Yeasttwo-hybrid,Y2H)2pull-down3免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)4雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)(Biomolecularfluorescencecomplementation,BiFCorSplitYFP)5Far-westernanalysis3酵母雙雜交技術(shù)3.1原理DNA-bindingandactivatingfunctionsinatranscriptionfactormaycompriseindependentd

3、omainsoftheprotein.ThetwohybridtechniqueteststheabilityoftwoproteinstointeractbyincorporatingthemintohybridproteinswhereonehasaDNA-bindingdomainandtheotherhasatranscription-activatingdomain.3.2酵母雙雜交文庫(kù)構(gòu)建與篩選BDMatchmaker?LibraryConstruction&ScreeningKits誘餌蛋白載體構(gòu)建

4、pGADT7-RecVectorInformation文庫(kù)構(gòu)建ConstructingADfusionlibrariesbyrecombination-mediatedcloninginyeast.cDNAlibraryofoilseedrapelineRS-1constructedinyeastYeastcellsthataremating.Azygotetypicallyhasthree-lobedshape,thelobesrepresentingthetwohaploid(parental)cellsan

5、dthebuddingdiploidcells.LibraryscreeningbymatingPositiveclonesconfirmedonSD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-a-Gal檢測(cè)特定兩個(gè)蛋白是否互作pGADT7VectorInformation3.3膜蛋白互作研究方法---基于泛素的酵母雙雜交體系(mating-basedSplitubiquitinsystem"mbSUS“)1)GAL4體系的缺點(diǎn)2)MbSUS體系mbSUS原理InvivocloningintombSUSvect

6、orsGATEWAYcloningmethod4pulldown1)原理2)試劑盒TheMagneGST.Pull-DownSystemFigure1.OverviewoftheMagneGST.Pull-DownSystemprotocol.P=PreyProtein,M=MagneGST.Particle.5免疫共沉淀Co-IP6Far-westernanalysis雙分子熒光互補(bǔ)(bimolecularfluorescencecomplementation,BiFC)分析技術(shù),利用綠色熒光蛋白(greenf

7、luorescentprotein,GFP)及其突變體(YFP,CFP,BFP)的特性作為報(bào)告基因,將熒光蛋白分割成兩個(gè)不具有熒光活性的分子片段,再分別與目標(biāo)蛋白連接.如果兩個(gè)目標(biāo)蛋白因?yàn)橛邢嗷プ饔枚拷?,就使得熒光蛋白的兩個(gè)分子片段在空間上相互靠近,重新形成活性的熒光基團(tuán)而發(fā)出熒光.在熒光顯微鏡下,就能直接觀察到兩目標(biāo)蛋白是否具有相互作用,并且在最接近活細(xì)胞生理狀態(tài)的條件下觀察到其相互作用發(fā)生的時(shí)間、位置、強(qiáng)弱、所形成蛋白質(zhì)復(fù)合體的穩(wěn)定性,以及細(xì)胞信號(hào)分子對(duì)其相互作用的影響等,這些信息對(duì)研究蛋白質(zhì)相互作用有一定

8、意義。7雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)BiFCPrincipleoftheBiFCassayGFP的特性綠色熒光蛋白(GFP)來(lái)源于水母(Aequoreavictoria),分子質(zhì)量約為27kda,能在各種細(xì)胞中表達(dá).受到激發(fā)時(shí),不需要任何輔助因子,就能在活體中發(fā)出綠色熒光.1992年,Prasher等[2]克隆了GFP基因.隨后,GFP作為一種研究基因表達(dá)和蛋白質(zhì)定位的活體可遺傳標(biāo)

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