四環(huán)素調(diào)控的重組酵母細胞的構(gòu)建及對豬尿中四環(huán)素類殘留的篩檢研究

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1、分類號學(xué)號Ｍ１５０８２７ＵＤＣ密級爆叫大聲ＹＡＮＧＺＨＯＵＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ｜Ｊ碩士學(xué)位於文（學(xué)術(shù)型）四環(huán)素調(diào)控的重組酵母細胞的構(gòu)建及對豬尿中四環(huán)素類殘留的篩檢研究徐秀舉：李湘鳴教授，２２５００９指導(dǎo)教師姓名，揚州大學(xué)，江蘇揚州申請學(xué)位級別：碩士學(xué)科專業(yè)名稱：流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計學(xué)論文提交日期：２０１８年４月５日論文答辯曰期：２０１８年５月３１日學(xué)位授予單位：揚州大學(xué)學(xué)位授予日期：２０１８年６月３０日答辯委員會主席：李國才教授２０１８年５月Ｉ徐秀舉：四環(huán)素

2、調(diào)控的重組酵母細胞的構(gòu)建芡對豬尿中四環(huán)素類殘留的篩檢研究四環(huán)素調(diào)控的重組酵母細胞的構(gòu)建及對豬尿中四環(huán)素類殘留的篩檢研究摘要目的：（Ｔ）構(gòu)建四環(huán)素反應(yīng)元件ｅｔｒａｃｃｌｉｎｅＲｅｓｏｎｓｅＥｌｅｍｅｎｔＴＲＥ調(diào)控的重組基因酵母細胞，ｙｐ，十快速檢測動物食品中四環(huán)素類抗生素的殘留。方法：－－－．３磷酸１ｉ汕醛脫氫釀，Ｇｌｃｅｒａｌｄｅｈｄｅ３１用ＰＣＲ方法從酵母ＤＮＡ提取液中擴增ＧＰＤ（ｙｙ？ＰｈｏｓｈａｔｅＤｅｈｙｄｒｏ－ｅｎａｓｅ）雄因后動子．ＹＥＳＴｒｐｇ，將Ｋ插入到酵母表達載體ｐｐ２，從而構(gòu)建ＧＰＤ

3、Ａ動子驅(qū)動的酵母農(nóng)達載體ＧＰＤ。ｐ２．人工合成雙股Ｖ５抗說表位ＤＮＡ，將其插入ｐＧＰＤ載體；以質(zhì)粒ｐｃＤＮＡ６／ＴＲ為模板丨（ＴｅｔｒａｃｃｌｉｎｅＲｅｒｅｓｓｏｒＰｒｏｔｅｉｎ，ｔｅｔＲ）基因，并與ＧＰＤ載，ＰＣＲ擴增四環(huán)素阻逆蛋廣ｙｐｐ體的Ｖ５抗原表位ＤＮＡ相融合，，構(gòu)建成ＧＰＤ驅(qū)動的ＴＲ酵母表達載體并轉(zhuǎn)化于酵母細－胞Ｗ３０３１Ａ，用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ方法鑒定ｔｅｔＲ基因的表達。３．人工合成四環(huán)素反應(yīng)元件（ＴｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅＲｅｓｐｏｎｓｅＥｌｅｍｅｎｔ，ＴＲＥ），將其插入ｐＭＰ２０６ａｃＺ（－半乳糖苷

4、酶基因酵母報告載體的ＣＹＣ１啟動子與報告基因Ｌｐ）之間，構(gòu)建成ＴＲＥａｃＴ－ＬＺ。調(diào)控的ＬＺ酵母報告載■體ｐｙｅｔｏｎａｃ（？４．以ｐＹＥＳＴｒｐ２栽體為模板，ＰＣＲ擴增ＧＡＬ１ｔ乳糖誘導(dǎo)型啟動子蕋因）啟動子，－取代ＴｅｔｏｎＬａｃＺ載體上的ＣＹＣ１（細胞色素氧化４＿１）Ａ動子，構(gòu)建成ＧＡＬ１驅(qū)動ＴＲＥｐｙ調(diào)控的ＬａｃＺ酵母報告載體，并轉(zhuǎn)化于可高效表達ＴＲ的酵母細胞中，對陽性克隆用四環(huán)素進彳ｆ誘導(dǎo)，分析其靈敏度和特異度。５．從揚州市某養(yǎng)豬場收集１４６例豬尿樣本，以ＥＬＩＳＡ方法作為金標(biāo)準(zhǔn)，用重組酵母細，與金

5、標(biāo)準(zhǔn)方法進行比較分析研宂胞方法對其尿液中四環(huán)素類抗生素進行檢測。結(jié)果：已成功轉(zhuǎn)化于Ｗ－ＰＤ啟動子、ｔｅｔＲ基因３０３１Ａ酵母細胞，片段大．經(jīng)ＰＣＲ鑒１定發(fā)現(xiàn)Ｇ一ｅｒｎｂｌｏ，ｔｅＲ基因己成功在酵母細胞中表小與預(yù)期的基因片段大小致；用Ｗｅｓｔｔ方法分析ｔ達，蛋白大小為２２ＫＤ。２．經(jīng)ＰＣＲ鑒定發(fā)現(xiàn)ＧＡＬ１驅(qū)動的ＴＲＥ調(diào)控的重組ＬａｃＺ酵母細胞構(gòu)建成功；所構(gòu)建的四環(huán)素調(diào)控的重組酵母細胞與四環(huán)素類抗生素有明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系，而與非四環(huán)素類抗ＩｉｉＩ揚州大學(xué)碩士學(xué)ｉｉ侖文生素?zé)o劑量效應(yīng)關(guān)系，說明有良好的靈敏性和特異性

6、。３．重組酵母方法與ＥＬＩＳＡ方法比較發(fā)現(xiàn)，兩種方法測定的陽性率有統(tǒng)計學(xué)差異２－６＝（＝２２．５６８８＞＜＜．．乂，戶丨．１丨〇〇〇１）。經(jīng)１１〇（：曲線分析，發(fā)現(xiàn)重組酵母方法的靈敏度為７６３６％，但是，其特異度和符合率不高，分別為４３．９６％和５６．１６％；約登指數(shù)為０．２０３，陽性似然比＋（－（ＬＲ）為１３６３，ＬＲ）為０．５３８，陽性預(yù)測值為４５．１６％，陰性預(yù)測值為７．４７％；．陰性似然比５重組酵母方法與ＥＬＩＳＡ法均可發(fā)現(xiàn)混合四環(huán)類抗也素之間的聯(lián)合效應(yīng)，但是，重組酵母對四環(huán)類抗生素混合物聯(lián)合作用相對較敏感。結(jié)論：

7、－－－所構(gòu)建的重組酵母細胞３０３－１Ａ／ＴＲＧＡＬ１ＴｅｔＬＺ）對四環(huán)類抗生素混合物聯(lián)（Ｗｏｎａｃ一合效應(yīng)較敏感，對家畜尿液中四環(huán)類抗生素殘留有定程度的快速篩檢作用，但是，其特一異度和靈敏度還需進步研究提高。關(guān)鍵詞：重組酵母細胞四環(huán)素類抗生素ＥＬＩＳＡ檢測食品安全徐秀舉１Ｕ：四環(huán)素調(diào)控的重組酵母細胞的構(gòu)建及對豬尿中四環(huán)素類殘留的篩儉研究Ｔｈｅｓｔｕｄｏｎｔｈｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｅａｓｔｃｅｌｌｓｙｙｒｅｇｕｌａｔｅｄｂｙｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅａｎｄｔｈｅ

8、ｓｃｒｅｅｎｉｎｇｏｆｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅｒｅｓｉｄｕｅｓｉｎｉｕｒｉｎｅｐｇＡＢＳ