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《三種嗜熱轉氨酶的克隆表達及表征》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在學術論文-天天文庫。
1、：１０６９７分類號：Ｑ７學校代碼：２０１５２０８７９密級：公開學號ＮｏｒｔｈｗｅｓｔＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｉ頎士字位論文ＭＡＳＴＥ＇ＲＳＤｉＳＳＥＲＴＡＴＩＯＮ三種嗜熱轉氨酶的克隆表達及表征學科名稱：生物化學與分子生物學：高文運教授作者：華水紅指導老師西北大學學位評定委員會二〇—八年六月摘要摘要ω-轉氨酶是一種可用于制備光學純α-手性胺的工具酶，而大量生物活性化合物或合成前體具有α-手性胺結構片段，因此ω-轉氨酶為具有手性胺結構特征的生物活性化合物的不對稱合成提供了獨特的手段。本研究通過基因工程的方法克隆了三種不同來源的嗜熱轉氨酶基因
2、，分別來自于海棲熱袍菌（Thermotogamaritima）、嗜熱鏈球菌（SphaerobacterThermophilus）和嗜熱集胞藻（Thermosynechococcussp.NK55a,TN），將目的基因分別與載體pET30a進行連接后轉化到大腸桿菌BL21（DE3）細胞中，構建可應用于制備耐熱轉氨酶的工程菌，誘導表達后通過親和層析純化的方法得到三種不同的嗜熱轉氨酶，即重組海棲熱袍菌N-乙酰鳥氨酸轉氨酶（AcOAT）、嗜熱鏈球菌ω-轉氨酶（ω-TAST）、嗜熱集胞藻轉氨酶（TATN），經SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)，其中AcOAT和ω-TAST均為可溶性表達，而TATN表
3、達為包涵體形式。分別對兩種可溶性表達的轉氨酶AcOAT和ω-TAST的酶學性質進行表征。實驗結果表明AcOAT和ω-TAST的最適pH均為8.0，但隨著pH的變化它們活性的變化趨勢不同；它們的最適溫度均為60℃，但AcOAT的耐熱程度更高，在100℃時仍有活性，而ω-TAST在80℃時就幾乎沒有活性了；這兩種酶的最適2+2+2+2+2++反應時間均為1h。還測定了Zn、Ca、Mg、Fe、Mn、Na這幾種金屬離子對AcOAT活性的影響，發(fā)現(xiàn)均對酶的活性有不同程度的抑制，為研究AcOAT的抑制劑提供了實驗基礎。由于所檢測的ω-TAST的底物大多難溶于水，需要用助溶劑助溶，因此還測定了
4、助溶劑對ω-TAST活性的影響。結果顯示當甲醇濃度為10%時，酶活性僅剩10%左右，因此甲醇不適合作為ω-TAST的助溶劑；而對于DMSO來說，當其濃度高達25%左右的時候，ω-TAST仍具有80%以上的活性，因此DMSO可以用作ω-TAST的助溶劑。實驗中還測定了AcOAT和ω-TAST的Km值，AcOAT對N-乙酰-L-鳥氨酸的最大反應速率Vmax為32.71μmol/min，Km值為6.7mM；ω-TAST對(S)-α-MBA的最大反應速率Vmax為36.50μmol/min，Km值為1.25mM。進一步，還探討了兩種酶對不同的氨基供體和氨基受體的相對活性大小，表明這兩種不
5、同來源的轉氨酶對于不同的氨基供體和氨基受體所表現(xiàn)出的活性有較大的差異。關鍵詞：嗜熱轉氨酶；活性；可溶性表達；酶學性質I西北大學碩士學位論文Abstractω-Transaminasesareapotentialtoolforpreparingopticallypureα-chiralamines.Sincealargenumberofbiologicallyactivecompoundsorsyntheticprecursorshaveα-chiralaminestructuralmoieties,ω-transaminasesofferauniqueopportunityfor
6、theasymmetricsynthesisofbioactivecompoundswithchiralaminesubstructures.Inthisthesis,threethermophilicaminotransferasegenes,separatelyfromThermotogamaritima,Sphaerobacterthermophilus,andThermosynechococcussp.NK55a(TN)wereclonedbymolecularcloning,thetargetgeneswerethenrespectivelyligatedwiththe
7、vectorpET30aandtransformedintoE.coliBL21(DE3)cellstoconstructtheengineeringstrainsthatcouldbeusedtoprepareheat-resistanttransaminases.Afterinducingexpressionandpurificationbyaffinitychromatography,threedifferentthermophilictransaminases,namel
