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《馬鈴薯Y病毒HCPro和甘蔗花葉病毒CP基因的克隆、原核表達與抗血清制備》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、山東農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文馬鈴薯Y病毒HC-Pro和甘蔗花葉病毒CP基因的克隆、原核表達與抗血清制備姓名：石鵬君申請學位級別：碩士專業(yè)：植物病理學指導教師：李向東20040613中文摘要血清學方法是植物病毒診斷和鑒定病毒的重要方法，在植物病毒的檢疫、預測預報、植物病毒的定位、增殖、移動和基因功能等方面研究中也發(fā)揮著重大作用。以往用提純的病毒粒體為抗原制備抗血清存在一些缺陷，如有些病毒含量非常低、不易提純，所得抗血清中常含有寄主蛋白的抗體等。通過基因工程技術使病毒的基因在原核細胞中表達，以表達產(chǎn)物作為抗原制備抗血清，可以部分解決以上問題。本研究主要結果如下：1分別以馬鈴薯Y病毒(Pota
2、tovirusy，PVY)N和O株系分離物的RNA為模板，通過RT-PCR克隆到PVY“、pVyoHC-Pro基因，并對其進行了序列分析。測序結果表明兩個HC—Pro基因全長均為1368nt，編碼456個氨基酸。兩個基因的核苷酸同源性為99．71％，氨基酸同源性為99．56％。2將PVY“HC．Pro基因克隆到pET22b(+)上，構建了原核表達載體pETHC，使HC．Pro基因在大腸桿菌中得到高效表達。用原核表達的HC．Pro免疫家兔，獲得了HC-Pro的抗血清。3應用RT-PCR和特異引物從泰安采集的感染矮花葉病的玉米植株總RNA中擴增到一個大約1kb的片段，與克隆載體pUCl8
3、連接后通過熱激法轉化大腸桿菌DH5ct。序列測定和結果的表明，泰安地區(qū)玉米花葉病由甘蔗花葉病毒(SCMV)引起，該病毒泰安分離物(scMV一1A)CP基因含939個核苷酸，編碼313個氨基酸。泰安分離物和國內報道的SCMV分離物(特別是山東分離物)有很高的氨基酸序列同源性，而與其它病毒的同源性較低。4將SCMV-TA的外殼蛋白基因克隆到表達載體pET22b(+)，并在大腸桿菌BL21(DE3)中得到高效表達，表達蛋白約占總蛋白的15％。用此蛋白制備了效價高、?；詮姷目贵w。關鍵詞：馬鈴薯Y病毒；輔助成分一蛋白酶；甘蔗花葉病毒；外殼蛋白基因；克隆；原核表達AbstractSerolog
4、icalmethodshavebeenprovedtobesensitiveandspecificindetectingandidentifyingviruses．Theyalsoplayedgreatrolesinstudyinglocalizationofviralproteins，functionsofviralgenes，transmissionmechanism，andvirus—hostinteractions．However,therewereseveralpotentialdisadvantagesforserologiealstudies．Forexample，so
5、mevirusesexistedinplantsatverylOWconcentrationandweredi伍cultto1)epurified．Someantiseracontainednon．specificantibodiestohost03nstituents．AntibodyraisedagainstviralproteinexpressedinE．colimightpartlysolvetheseproblems．111emainresultsofthisstudyread嬲follows：1．TheHC．ProgenesofPVyNandPVyOwereamplifi
6、edlwRT-PCRandtheitcompletenucleotidesequencesweredetermined．111eresultsshowedthattheyallcomposedof1368nt，eachencodedflprateinof456aminoacids．Sequencecomparisonshowedthesetwogeneshadanidentitvof99．71％atnucleotideleveland99．56％ataminoacidlevel．Ⅱ忙YsharehigherhomologywithotherstrainsofPVYthanwithot
7、hervirusesofPotyvirus．2．TheHC．ProgeneofPVY“wasclonedintoexpressionvectarpET22b(+)andtrailsferredintoE．colfBL21(DE3)．SDS．PAGEshoweditcouldbeexpressedtohi出levelwheninducedwithIPTGthemolecularweightofthefusionproteinisca．53kD．nle53kD
