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《HBsAb快速定量檢測(cè)上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫層析試紙的研制及臨床應(yīng)用》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫(kù)。
1、·中文論著摘要·快速定量檢測(cè)HBsAb上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫層析試紙的研制及臨床應(yīng)用目的乙型肝炎病毒(HepatitisBVirus，HBV)是一種嚴(yán)重危害人類健康的致病因子，是慢性肝炎、肝硬變和肝細(xì)胞癌最重要的病因之一。據(jù)估計(jì)，全球有3億人是HBV的持續(xù)攜帶者，其中1／3在中國(guó)。全球約45％的人口生活在慢性HBV感染的高風(fēng)險(xiǎn)地區(qū)，約20億人感染HBV，每年有100萬(wàn)人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原發(fā)性肝癌。我國(guó)屬HBV感染高流行區(qū)，一般人群的乙型肝炎表面抗原(hepatitisBsurfaceantigen，HBsAg)陽(yáng)性率為9．75％。盡管疫苗接種卓有成效，但仍有部分人群對(duì)乙肝疫
2、苗無(wú)應(yīng)答。諸多因素，包括衰老、吸煙、肥胖、性別和遺傳因子等均與免疫應(yīng)答的降低相關(guān)，男性無(wú)應(yīng)答者的出現(xiàn)頻率高于女性。因此，定量檢測(cè)各類疫苗接種者在接種后的乙型肝炎表面抗體(hepatitisBsurfaceantibody，HBsAb)水平十分必要，特別是檢測(cè)疫苗接種后的醫(yī)務(wù)工作者，對(duì)防止HBV在醫(yī)院內(nèi)的傳播具有重要意義。對(duì)于那些為防止因偶然因素導(dǎo)致母嬰傳播和接觸傳播而注射乙肝免疫球蛋白(hepatitisBimmunoglobulin，HBIg)的個(gè)體來(lái)說，定量檢測(cè)HBsAb也十分重要。肝移植接受者為了預(yù)防乙肝，通常需要注射HBIg。為了有效預(yù)防乙肝的發(fā)生，血液中的HBIg水平應(yīng)當(dāng)高
3、于100mlU／mL。因此，開發(fā)血液中HBIg的定量檢測(cè)技術(shù)也勢(shì)在必行。上轉(zhuǎn)發(fā)光(up—convertingphosphor，UCP)材料是一種含有稀土元素的亞顯微陶瓷微粒，它的特殊組成和結(jié)構(gòu)為其提供一個(gè)獨(dú)特的光學(xué)特征，既在紅外光激發(fā)下，可以發(fā)射可見光。這種能量上轉(zhuǎn)現(xiàn)象使UCP成為一種能夠擺脫熒光焯滅現(xiàn)象和樣品自發(fā)熒光干擾的示蹤物。UCP作為示蹤物與免疫層析(1ateral．flow，LF)技術(shù)結(jié)合而成的上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫層析檢測(cè)技術(shù)(UCPtechnology．basedLFassay，UPT．LF)為高敏感性的、精確的定量檢測(cè)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。目前已經(jīng)開發(fā)出多種UPT免疫層析試紙，并且
4、在違禁藥品監(jiān)控、核酸、INF7、血吸蟲循環(huán)抗原、大腸埃希菌、鼠疫耶爾森菌、呼吸道合胞病毒等的敏感檢測(cè)中顯示了UCP示蹤物的作用。但迄今為止，在國(guó)內(nèi)外的相關(guān)文獻(xiàn)中，尚未發(fā)現(xiàn)UCP．LF在HBV血清標(biāo)志物定量檢測(cè)方面的應(yīng)用。本研究的目的是研制一種用于定量檢測(cè)HBsAb的上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫層析技術(shù)，并通過對(duì)臨床樣品的檢測(cè)評(píng)估其應(yīng)用的可行性。實(shí)驗(yàn)方法利用PCGENE計(jì)算機(jī)軟件，分析已知的HBV基因組序列，結(jié)合國(guó)內(nèi)克隆的HBsAg編碼區(qū)序列設(shè)計(jì)、合成引物。擴(kuò)增目的基因的，回收、純化PCR產(chǎn)物，與pGEM．Teays載體的TA克隆連接。從亞克隆質(zhì)粒載體中獲取S基因，與表達(dá)載體pRESET．A的連接，采
5、用DH5a感受態(tài)細(xì)菌試劑盒轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物，篩選及鑒定重組克隆。挑取轉(zhuǎn)化工程菌單菌落，接種于LB(含氨芐青霉素50I_tg／ml和氯霉素35}tg／m1)液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。培養(yǎng)物中加入異丙基硫代半乳糖昔(IPTG)至終濃度為lmol／L，37。C振搖培養(yǎng)，誘導(dǎo)培養(yǎng)4h。收集細(xì)菌，選擇最佳IPTG誘導(dǎo)濃度。Tris．甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS．PAGE)分析表達(dá)產(chǎn)物，大量表達(dá)工程菌，采用HisTrap親和層析柱純化His融合蛋白，Westernblot分析表達(dá)產(chǎn)物。UCT免疫層析試紙主要是由五部分組成，包括：樣品摯、結(jié)合墊、分析膜、吸水墊和粘性底襯。樣品墊、結(jié)合墊
6、、分析膜和吸水墊通過粘膠固定于粘性底襯上。HBsAg和羊抗HBsAg分別包被在分析膜上作為檢測(cè)帶和質(zhì)控帶。將UCP-HBsAg結(jié)合物固化在結(jié)合摯上，特殊的終點(diǎn)指示帶能顯示顏色變化，用以提示免疫層析反應(yīng)的結(jié)束。將制備完成的測(cè)試條放入塑料盒式存儲(chǔ)器內(nèi)，樣品墊、分析膜(檢測(cè)帶和質(zhì)控帶)、吸收墊(終點(diǎn)指示帶)的連接部分重疊，分別對(duì)應(yīng)加樣孔、結(jié)果掃描窗和終點(diǎn)指示窗。將70“L血清樣品和70“L樣品處理緩沖夜混合后，加到加樣孔中。當(dāng)樣品墊被浸透后(約在加樣后10min)，樣品的流動(dòng)將停止，而此時(shí)在吸水墊末端的終點(diǎn)指示帶將由白色轉(zhuǎn)變?yōu)樗{(lán)色，提示UPT傳感器讀取結(jié)果。UPT傳感器掃描在分析膜上的檢測(cè)
7、帶和質(zhì)控帶，以采集數(shù)據(jù)。陽(yáng)性樣品將出現(xiàn)2個(gè)主要的峰值信號(hào)(檢測(cè)帶和質(zhì)控帶)，而陰性樣品將只出現(xiàn)一個(gè)單一的主要峰值信號(hào)(只有質(zhì)控帶)。對(duì)應(yīng)檢測(cè)帶和質(zhì)控帶的峰值區(qū)域分別命名為T和C，T／C的比率即為檢測(cè)結(jié)果。在2本研究中是采用本法檢澳tJ52份健康獻(xiàn)血者的血清樣品，以確定其cut．O髓。本研究中，同時(shí)應(yīng)用目前常規(guī)檢i貝lJHbsAb的二種方法抗原夾心法ELISA和雅培酶促免疫熒光試驗(yàn)(AbbottAxsymAUSABassay，AUSAB)檢測(cè)HBsA-b，以
