地中海實蠅及其近緣種和桔小實蠅復合種基因芯片的研制及應(yīng)用

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1、摘要檢疫性實蠅的鑒定是國際果蔬貿(mào)易中最突出的技術(shù)問題之一。我國農(nóng)業(yè)部最新頒布的進境植物檢疫性有害生物名錄將小條實蠅屬Ceratitis、果實蠅屬BactroceraylJ入其中。目前，實蠅的口岸檢疫鑒定以傳統(tǒng)的形態(tài)學鑒定為主，此方法對鑒定者經(jīng)驗依賴性強，受實蠅蟲態(tài)、飼養(yǎng)周期等的限制。常規(guī)分子生物學的方法，如PCR、探針雜交等檢測技術(shù)只能一次對一種實蠅進行檢測，不能滿足實際檢測的需要?；蛐酒夹g(shù)不但可以彌補上述方法自動化程度低、檢測分子數(shù)量少和低通量等不足之處，而且能大大提高檢測效率。本研究應(yīng)用基因芯片技術(shù)，建立了地中海實

2、蠅Ccapitata及其近緣種和桔小實蠅丑dorsalis復合種兩種基因芯片，用于地中海實蠅三個近緣種和桔小實蠅五個復合種的鑒定，同時具有小條實蠅屬、果實蠅屬實蠅初篩的功能。本研究獲得了如下主要結(jié)果：1．地中海實蠅及其近緣種和桔小實蠅復合種基因芯片的制備選擇線粒體DNA(mtDNA)細胞色素氧化酶I基I因(COI)為分子標記基因，根據(jù)Genbank發(fā)表的實蠅科昆蟲mtDNA．COI序列，運用DNAstar軟件，分析基因序列間的差異性，先后設(shè)計合成通用引物2對。在通用引物擴增區(qū)間內(nèi)，設(shè)計了檢測探針16條，分別是實蠅科通用探針

3、1條，小條實蠅屬通用探針1條，果實蠅屬通用探針1條，桔小實蠅亞屬通用探針1條，地中海實蠅、芒果小條實蠅Ccosary和納塔爾小條實蠅Crosa近緣種探針2條和種特異探針4條，桔小實蠅、木瓜實她papayae、楊桃實衄carambolae、菲律賓實她philippinensis、芒果實衄occipitalis等復合種探針6條；設(shè)計了質(zhì)控探針3條，分別是定位點探針、陽性質(zhì)控探針和陰性質(zhì)控探針各1條。將探針按照相應(yīng)陣列點樣至醛基化基片，用NANO．PLOTrER2芯片點樣儀分別點樣，制備出地中海實蠅及其近緣種芯片和桔小實蠅復合種

4、芯片兩種檢測芯片。2．地中海實蠅及其近緣種和桔小實蠅復合種基因芯片雜交條件的優(yōu)化芯片雜交條件的優(yōu)化主要包括芯片雜交體系模板DNA濃度(O．09ng／／tL，O．18ng／／aL，0．45ng／,uL，0．9ng／,uL)、雜交時間(1h，2h，6h)、雜交液濃度(O．5xSSPE，2％SDS；lxSSPE，2％SDS；5xSSPE，2％SDS；7．5xSSPE，2％SDS10xSSPE，2％SDS；3xBlocking)和雜交溫度(42℃，44℃，46℃)的優(yōu)化。篩選出當模板DNA濃度為0．9n幽L；雜交時間3h；雜交液濃

5、度為：10xSSPE，2％SDS；雜交溫度為46℃時，能獲得較好的雜交信號。3．地中海實蠅及其近緣種和桔小實蠅復合種兩種基因芯片的初步應(yīng)用用制備好的地中海實蠅及其近緣種基因芯片檢測了地中海實蠅(不同蟲態(tài)和地理種)、納塔爾小條實蠅和芒果小條實蠅；用桔小實蠅復合種基因芯片檢測了楊桃實蠅(不同蟲態(tài))、桔小實蠅、木瓜實蠅、菲律賓實蠅、芒果實蠅，兩種芯片的檢測結(jié)果與常規(guī)形態(tài)學鑒定結(jié)果完全吻合。結(jié)果表明兩種基因芯片可以作為實蠅快速檢測的一種重要手段。關(guān)鍵詞：實蠅科，地中海實蠅，桔小實蠅，近緣種，復合種，基因芯片，分類鑒定jnABSTR

6、ACTIdentificationofQuarantinefruitfly(Diptera：Tephritidae)isoneofthemostimportanttechniqueproblemintheinternationalfruitsandvegetabletrade．ThelatestpublishedquarantinelistofChinahasincludeedtheCeratitisMacleayandBactroceraMacqurtasdetrimentalorganisms．Currentmetho

7、dforidentificationoffruitflymainlyba，sedonthemorphologicalmethod．However,itdependsontheexperienceofidentifiersandisrestrainedfromtheshapeandthebreedingperiodoffruitfly．PeRtechniqueisarapid，precisemethodforthedetectionoffruitnv．butcurrentmethodsbasedPeRonlycandetec

8、tonesortoffruitflyeachtime，whichcannotsatisfytheactualapplieddemands．ThisstudyestablishamethodofgenechipfortheidentifyingofCeratitiscapitata，anditsrelat