資源描述：
《陰溝腸桿菌B8拮抗相關(guān)基因簇的克隆及功能驗證》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院碩士學(xué)位論文陰溝腸桿菌B8拮抗相關(guān)基因簇的克隆及功能驗證姓名：朱軍莉申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：預(yù)防獸醫(yī)學(xué)指導(dǎo)教師：余旭平20040501浙江大學(xué)碩：L學(xué)位論文摘要陰溝腸桿菌B8是從水稻葉面分離獲得的一株廣譜拮抗菌．最初分離篩選時以白葉枯病菌作為指示菌，發(fā)現(xiàn)它對白時枯病菌具有很強的拮抗活性，網(wǎng)室及用閩定殖和抗白葉枯病試驗也取得了較滿意的結(jié)果。進一步發(fā)現(xiàn)它對水稻和蔬菜等的多種病原有良好的拮抗效果，還對人和動物的葡萄球菌等細菌也具有良好的抑制作用，因此它是一株具有良好生物防治潛力拮抗細菌。本研究從基因水平對B8菌株拮抗分子機理進行了研究，為該菌株更好地應(yīng)
2、用于生物防治提供理論基礎(chǔ)。通過轉(zhuǎn)座子標簽法已獲得拮抗活性消失的突變菌B8F和B8B。并克隆到質(zhì)粒pTLF和pTLB。經(jīng)亞克隆測序獲得pTLF質(zhì)粒的735bpF片段序列，應(yīng)用GPS．1系統(tǒng)測序獲得pTLB質(zhì)粒的2608bpB片段序列。在獲得這兩個片段序列基礎(chǔ)上，設(shè)計合成多種接頭，構(gòu)建不同接頭的多個B8基因組文庫．應(yīng)用相應(yīng)的接頭引物和根據(jù)己知序列設(shè)計的特異引物進行PCR，經(jīng)4次染色體步行獲得了F片段(Tn5插入位點)左側(cè)的2586bp序列和右側(cè)的664bp序列，與F片段序列拼接，獲得3985bp的Fcontig序列；經(jīng)2次步行獲得了B片段右側(cè)的2003bp序列，與B片段
3、序列拼接，獲得461lbp的Bcontig序列。生物信息學(xué)分析顯示，F(xiàn)contig中包含4個ORF，與Pantoeaagglomerans的andrimid生物合成基因簇(AYl92157)的admL、admM、admN和admO四個基因有較高的同源性：被Tn5插入破壞的ORF(命名為anrF)對應(yīng)于admM(polyketide合酶基因)，插入位點位于該基因的2369bp處，即終止密碼前214個堿基。而Bcontig序列包含7個ORF，3個位于Tn5插入位點的左側(cè)，依次為約200bp的3．磷酸甘油醛脫氫酶基因片段、390bp的調(diào)控因子ORF和450bp未知功能的O
4、RF，在前兩個ORF間的還有一段600bp與耶爾森氏菌高致病力毒力島問有一定同源性的序列：4個0I心位于Tn5插入位點的右側(cè)，其中3個分別與andrimid生物合成基因簇的admA、admB和admC三個基因?qū)?yīng)并有較高的同源性，另～個408bp的ORF(命名為anrP)位于'admA’基因前286bp處．Tn5插入于'admA’基因前894bp的“非編碼區(qū)”，即anrP基因上游200bp處。同時對Tn5插斷的徹rF基因和ArtrB片段進行PCR驗證及片段兩端測序。由此證明我們已經(jīng)克隆到f5f】溝腸桿菌B8拮抗相關(guān)基因片段。為了證明陰溝腸桿菌B8的基因組存在類似an
5、drimid生物合成基因簇的拈抗相關(guān)基因簇，本研究應(yīng)用了長距離PCR(LAPCR)擴增大片段DNA。選擇B3750—90浙遼大學(xué)硬士學(xué)但論文和F2000引物，并應(yīng)用EXTaq酶擴增出‘a(chǎn)dmA’基因和anrF基因之間預(yù)期的12．5kb片段。PCR產(chǎn)物經(jīng)HindIII酶切后。獲得BAI、BA2和BA3三條帶，將兩端均帶有HindIII酶切末端的BA2片段克隆到經(jīng)HindIII酶切和CIAP處理的pUCl8質(zhì)粒，并對BA2整個片段進行了測序。在已知BA2片段序列的基礎(chǔ)上．設(shè)計擴增BAl’和BA3’片段，并對BAI’片段進行了克隆和全序列測定。對BAl’、BA2序列編輯和
6、拼接后，得到4997bp的BAcontig，生物信息學(xué)分析顯示該序列與andfimid生物合成基因簇中的admC、admD、admE、admF、admG和admH有較高的同源性。另一方面，根據(jù)admT和admU基因的序列設(shè)計引物，擴增出436bp對等的‘口咖，丁’基因片段，而沒有得到'admU’基因片段。對該片段測序后，合成用于步行的引物．獲得了包含饑砌r鼉毒因及下游的517bp序列。對已獲得868bp序列分析顯示對等基因admT問的核苷酸和氨基酸的同源性分別為83．6％和89．7％，但是在3’端有一個氨基酸的缺失：而下游非編碼區(qū)序列與admT和admU基因間的非編
7、碼序列間同源性較低，并存在缺失和插入突變。與此同時，以"admO’基因上的FSl和。admT’基因上的admT588為配對引物，應(yīng)用EXTaq酶PCR擴增出8288bp目的片段。由此可見，我們己獲到了B8拮抗相關(guān)基因簇的整個序列，并對部分基因迸行了測序。從得到的序列中發(fā)現(xiàn)，B8拮抗相關(guān)的基因在基因大小、結(jié)構(gòu)、閱讀框架排列等多方面與andrimid生物合成基因簇序列完全對應(yīng)；從同源性分析也顯示在基因的編碼區(qū)內(nèi)核苷酸和氨基酸的同源性均很高，在75％．92％之間，而非編碼區(qū)包括兩種基因簇的上游非編碼區(qū)、臼咖國’和'admE’之間的非編碼區(qū)及'admT’基因下游的非編碼
