中國野生葡萄抗寒基因RAPD標記的研究

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1、摘要2000年一2002年，通過田間葡萄雜交與播種育苗，獲得玫瑰香x黑龍江實生的F，代19株及北醇自交后代47株。運用RAPD技術(shù)，對中國野生葡萄12個種58個株系、歐洲葡萄加個品種、歐山雜交品種1個、歐美雜交品種2個、河岸葡萄2個株系及三個雜交組合(玫瑰香X黑龍江實生、北醇.,燕山(早)X河岸一3)的122株F，代共計205份材料進行了中國野生山葡萄抗寒基因分子標記研究。主要結(jié)果如下:1按照前人對中國野生葡萄抗寒性較系統(tǒng)的鑒定分析，首先以極抗寒親本黑龍江實生(山葡萄)、不抗寒親本玫瑰香(歐洲葡萄)及抗寒歐山雜種北醇為模板篩選引物。通過對110個隨機引物

2、的篩選，獲得7個特異性引物。進一步用7個特異性引物對15份極抗寒野生葡萄種質(zhì)及部分不抗寒野生種質(zhì)擴增，結(jié)果顯示，引物5241在供試的山葡萄9個株系及燕山(早)中擴增出一條約670bP特異性DNA片段;另一個引物S238在山葡萄的6個株系中擴增出一條約800by特異性DNA片段。然后以三個雜交組合玫瑰香x黑龍江實生、北醇因及燕山(早)X河岸一3的122株F,代及其親本為模板，引物5241分別在三個組合的部分后代中擴增出來自極抗寒親本(山葡萄、燕山葡萄)的670by特異性DNA片段;引物5238分別在前兩個組合的部分后代中擴增出來自極抗寒親本(山葡萄)的80

3、0by特異性DNA片段，這表明5241670和S238800是與中國野生葡萄抗寒基因相連鎖的RAPD標記。進一步以歐洲葡萄品種、中國野生葡萄株系、河岸葡萄株系、歐美雜種為試材，對所獲RAPD標記的遺傳特性進行了研究。結(jié)果證明這兩個RAPD標記是來自中國野生葡萄山葡萄，且可以向后代遺傳?？购騌APD標記也可以用作山葡萄做親本的抗寒育種分子標記輔助選擇的依據(jù).RAPD標記5241670較S2388o有著更廣泛的輔助選擇作用.2.中國野生葡萄抗寒基因RAPD標記的分離與遺傳表現(xiàn)，表明抗寒性是多基因控制的數(shù)量性狀遺傳。3建立了適于葡萄抗寒基因RAPD分析的反

4、應體系:在25k1反應混合液中，含模板DNA25ng,Mg"2.5mM,dNTPs0.25mM,TaqDNA聚合酶1.0U，隨機引物1A1,關(guān)鍵詞:中國野生葡萄，抗寒基因，RAPD標記第一章文獻綜述第一章文獻綜述'1.1葡萄凍害及其發(fā)生凍害是果樹生產(chǎn)的主要自然災害之一，也是世界許多地區(qū)提高果樹產(chǎn)量的限制因素。在加拿大，不耐寒樹種每5-10年發(fā)生一至二次較嚴重的凍害[1021。在美國的東部、中西部和部分西部地區(qū)，凍害也是葡萄生產(chǎn)的主要限制因子‘坦幻。我國葡萄生產(chǎn)也經(jīng)常遭受不同程度的凍害。由于葡萄種類和品種不同，其抗寒性存在很大差異。歐洲葡萄栽培品種性喜溫暖

5、，不耐寒冷，故我國北緯35℃以北采用埋土防寒，從而使葡萄樹體安全越冬。黃河中下游地區(qū)是不埋土防寒區(qū)，但由于每年寒潮到來時間和強度不同，有時也會出現(xiàn)凍害。如1976^-1977年和1989^-1990年冬春之際，以及1993年冬初，陜西關(guān)中和黃河故道地區(qū)的葡萄出現(xiàn)大面積凍害現(xiàn)象，輕者減產(chǎn)，重者地上部凍死而絕收""1.1991年春至1994年春發(fā)生了四次嚴重的早晚藉及低溫凍害，使我國北方從新孤至華北、東北各省均遭受到了嚴重凍害，給葡萄生產(chǎn)帶來了很大危害【5n1夸1.2葡萄抗寒性的研究抗寒性是指植物越冬期間對零下溫度的忍耐力‘2e1.在諸多植物逆境中以低溫脅迫

6、對植物的危害種類最多，面積最大.長期以來，人們對寒害的機理及抗寒理論進行了多方面的研究.葡萄的栽培面積及產(chǎn)量均居世界前列，但其主要栽培品種抗寒性差，在最低溫度低于一巧℃的地區(qū)即需埋土防寒越冬，給葡萄生產(chǎn)帶來諸多不便+].因此進行葡萄抗寒性研究具重要的理論意義和實踐價值。前人就葡萄抗寒性及其形態(tài)解剖、質(zhì)膜透性、生理生化、抗寒鑒定等方面進行了研究，現(xiàn)分述如下.殲。2.1葡萄抗寒性形態(tài)解剖指標的研究萌芽率、主蔓死亡率是衡量葡萄枝芽經(jīng)防寒越冬是否發(fā)生凍害及凍害輕重的重要指標I-1。樹體的不同部位也存在著抗寒力的差異.據(jù)資料記載，一般歐洲品種的充實芽眼能忍受一18

7、0C~-20℃的低溫，成熟枝條能忍受一22℃的低溫，多年生老蔓能忍受-200C--26℃的低溫，由此可見芽眼的抗寒力低于枝條。所以，在調(diào)查中出現(xiàn)有枝條組織鮮綠，傷流正常而芽眼凍死的情況;還有一年生新梢凍死而多年生老蔓的隱芽可以萌發(fā)的現(xiàn)象[BB]王麗雪等(1994)以顯微化學觀察表明，抗寒強的葡萄種類(如山葡萄、貝達)其枝條木栓層厚，細胞層數(shù)多，木栓化程度高[71]。應用石蠟切片技術(shù)和電鏡技術(shù)對不同種類品種葡萄根系的組織解剖結(jié)構(gòu)觀察顯示，抗寒種類品種組織結(jié)構(gòu)比較緊密，導管小而密度低(山葡萄的導管直徑是43.411m,‘密度為29.6個/mm,，而玫瑰香則為

8、71.6um和63.1個/mm2):射線發(fā)達(山葡萄及歐美雜交種每橫斷面有16^