沉默GRP78基因?qū)θ寺殉舶㏒KOV3細胞侵襲力的抑制作用

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1、沉默GRP78基因?qū)θ寺殉舶㏒KOV3細胞侵襲力的抑制作用【摘要】目的探討RNA干涉技術(shù)(RNAi)沉默葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)基因?qū)θ寺殉舶㏒KOV3細胞侵襲力的影響，闡明GRP78基因沉默對SKOV3細胞侵襲力抑制作用的生物學機制。方法設計并構(gòu)建pSilencerTM3.0H1GRP78siRNA重組質(zhì)粒，脂質(zhì)體介導轉(zhuǎn)染至SKOV3細胞。RTPCR和Western印跡法檢測GRP78基因表達;RTPCR檢測MMP2、MMP9mRNA表達;Transwell小室侵襲實驗檢測細胞侵襲力;Transwell小室遷移實驗檢測細胞遷移率。結(jié)果RTPCR及Weste

2、rn印跡檢測轉(zhuǎn)染GRP78siRNA重組質(zhì)粒SKOV3細胞GRP78基因表達抑制;RTPCR結(jié)果顯示與對照組相比轉(zhuǎn)染GRP78siRNA重組質(zhì)粒SKOV3細胞MMP2、MMP9mRNA表達降低;Transwell小室侵襲實驗和遷移實驗結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染GRP78siRNA重組質(zhì)粒SKOV3細胞穿透細胞數(shù)(P<0.05)和遷移率均明顯降低(P<0.05)。結(jié)論①轉(zhuǎn)染GRP78siRNA重組質(zhì)粒有效抑制SKOV3細胞GRP78基因表達;②抑制GRP78基因表達能降低SKOV3細胞的侵襲力和遷移力，有望為抑制卵巢癌轉(zhuǎn)移基因治療提供新的靶點?！娟P(guān)鍵詞】葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78;人卵巢癌SKOV

3、3細胞;RNA干擾;侵襲　卵巢癌具有早期容易發(fā)生腹腔廣泛轉(zhuǎn)移和播散的特性，故侵襲和轉(zhuǎn)移是影響預后的最主要因素之一〔1〕。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)在蛋白質(zhì)的折疊和轉(zhuǎn)運中有重要作用，是促進正常狀態(tài)下細胞蛋白質(zhì)成熟、維系細胞機能和生命的重要調(diào)節(jié)物質(zhì)〔2〕。已有研究證明GRP78在轉(zhuǎn)移瘤高表達，且GRP78表達水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度密切相關(guān)，說明GRP78在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中可能發(fā)揮調(diào)節(jié)作用〔3〕。實驗證實下調(diào)GRP78的表達可抑制腫瘤細胞體外侵襲力，同時抑制異種移植瘤的體內(nèi)生長和轉(zhuǎn)移〔4,5〕。目前針對GRP78在腫瘤侵襲作用的研究主要集中在胃癌、肝癌、乳腺癌等方面〔6,7〕，而

4、其在卵巢癌中的作用尚不清楚。本研究構(gòu)建GRP78siRNA重組質(zhì)粒，通過特異性下調(diào)卵巢癌細胞(SKOV3)中GRP78的基因表達，探討其對卵巢癌細胞侵襲和遷移能力的影響。1材料與方法1.1細胞系SKOV3細胞系購自中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所。SKOV3細胞培養(yǎng)在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基常規(guī)方法培養(yǎng)，0.25%胰酶消化傳代。1.2方法1.2.1試劑胎牛血清(購自美國Clark公司);RPMI1640培養(yǎng)基(購自美國Gibco公司);Trizol、Lipofectamine2000(購自美國Invitrogen公司);逆轉(zhuǎn)錄酶、

5、引物合成(購自大連寶生物工程公司);2×PCRmix(購自北京天根公司);pSilencerTM3.0H1siRNA表達載體(購自美國Amion公司);基因測序(上海生物工程公司);Transwell小室(8μm)、Matrigel(購自美國BD公司);GRP78抗體、二抗(購自美國SantaCruz公司);分析純試劑(購自北京鼎國生物工程有限公司)。1.2.2GRP78特異性siRNA表達質(zhì)粒構(gòu)建siRNA表達載體選用pSilencerTM3.0H1siRNA表達載體(Amion公司，美國)。根據(jù)GeneBank人GRP78基因mRNA已知序列(NM0

6、05347.3)，針對編碼區(qū)設計siRNA模板序列如下：正義3′GGAGCGCAUUGAUACUAGATT5′;反義3′UCUAGUAUCAAUGCGCUCCTT5′。用限制性內(nèi)切酶(BamHⅠ、HindⅢ)對pSilencerTM3.0H1GRP78siRNA重組質(zhì)粒(簡稱pSH1SiGRP78)進行雙酶切，陽性質(zhì)粒經(jīng)上海生物工程技術(shù)服務有限公司自動測序儀測序。1.2.3轉(zhuǎn)染SKOV3細胞SKOV3細胞接種于100mm平皿中，待細胞生長融合率達到80%～90%，按Lipofectamine2000說明書將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到S

7、KOV3細胞中：取16μg質(zhì)粒溶于800μlRPMI1640培養(yǎng)基中;將40μlLipofectamine2000溶于RPMI1640培養(yǎng)基，終體積為800μl;將上述兩種液體混勻，室溫孵育20min，形成DNALipofectamine2000復合物;SKOV3細胞用RPMI1640培養(yǎng)基洗3次，加入DNALipofectamine2000復合物，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng);4h后用含10%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)基洗3次，加入10ml