小鼠胚胎干細(xì)胞飼養(yǎng)層的制備

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1、小鼠胚胎干細(xì)胞飼養(yǎng)層的制備作者:胡一新,黃王景單位:1.貴州省貴陽市第二人民醫(yī)院,貴州貴陽5500032.貴陽醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院兒科,貴州貴陽550003【摘要】目的探討小鼠胚胎干細(xì)胞飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備。方法:小鼠胚胎成纖維細(xì)胞作為飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞。另在無飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)液中,含白血病抑制因子條件下培養(yǎng)小鼠胚胎干細(xì)胞,觀察兩種情況下胚胎干細(xì)胞的生長情況。結(jié)果:小鼠胚胎成纖維細(xì)胞呈放射狀或旋渦狀走行,胚胎干細(xì)胞呈克隆狀生長。結(jié)論:胚胎干細(xì)胞能良好生長,且保持未分化狀態(tài)?!娟P(guān)鍵詞】胚胎成纖維細(xì)胞;小鼠;胚胎干細(xì)胞Preparationoffeedercellsofmouseembryo

2、nicstemcellHUYi-xin1,HUANGJing2(1.TheSecondPeople′sHospitalofGuiyangCity,Guiyang550003,China;2.TheAffiliatedHospitalofGuiyangMedicalCollege,Guiyang550003,China)Abstract:ObjectiveToinvestigatethepreparationmethodsoffeedercellsofmouseembryonicstemcell.MethodMouseembryonicstemcellwereobserv

3、edintwoculturesystems:onfeedercellsoftheprimarymouseembryofibroblastsandinleukemiainhibititoryfactoronfree-feedercells.ResultsTheprimarymouseembryofibroblastswereobservedradiallyorcircinately.TheEScellscloneappearedtypically.ConclusionTheEScellscangrowwellandmaintaininthestateofundifferentiati

4、onundertheconditions.KeyWords:Embryofibroblasts;Mouse;Embryonicstemcell胚胎干細(xì)胞(embryonicstemcell,EScell)是具有自我更新和多向分化能力的一類增殖旺盛的細(xì)胞,具有向機(jī)體各種組織細(xì)胞分化的潛能。體外培養(yǎng)中,為保持ES細(xì)胞的不分化,往往需將其接種于一定的飼養(yǎng)層上或加入白血病抑制因子。目前常用的飼養(yǎng)層細(xì)胞有小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouseembryofibroblasts,MEF)、STO細(xì)胞等。由于STO細(xì)胞價(jià)格昂貴,不易獲得,故本試驗(yàn)選擇MEF為飼養(yǎng)層細(xì)胞,探討胚胎干細(xì)胞飼養(yǎng)層的制備方法,為

5、胚胎干細(xì)胞的體外培養(yǎng)打下基礎(chǔ)。1資料與方法1.1主要試劑及儀器:低糖DMEM培養(yǎng)基、非必須氨基酸(購自Gibco公司);小牛血清(購自杭州四季青公司);0.25%胰酶、胎牛血清(購自Hyclone公司);重組小鼠白血病抑制因子(rmLIF)(Chemicon公司產(chǎn)品)。1.2細(xì)胞株:小鼠胚胎干細(xì)胞E14細(xì)胞株由中山大學(xué)干細(xì)胞中心提供。1.3主要溶液的配制:小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouseembryofibroblasts,MEF)培養(yǎng)液:低糖DMEM+10%小牛血清。ES細(xì)胞培養(yǎng)液:高糖DMEM+15%胎牛血清,在無飼養(yǎng)層時(shí)另加入rmLIF10ng/ml。絲裂霉素:濃度為10μ

6、g/ml,以培養(yǎng)液新鮮配制。1.4方法1.4.1小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)的培養(yǎng):①取12~14d的妊娠小鼠,頸椎法處死后,用75%酒精浸泡5min。②無菌條件下剖腹,暴露子宮,取出胎鼠,置入盛有PBS的平皿內(nèi),充分洗滌以去除血跡。③去除胎鼠的頭、尾、四肢和內(nèi)臟,PBS液洗凈,用滅菌的眼科小剪刀把組織塊剪至1mm3大小,向組織塊加入適量的胰蛋白酶-EDTA消化液,37℃下消化2min。④加等體積含血清的培養(yǎng)基終止消化,靜置,將組織塊沉降后,將培養(yǎng)基吸至無菌試管中。⑤無菌試管離心(1000r/min)5min,棄上清,沉渣用含10%小牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)液懸浮后接種至25cm2

7、一次性培養(yǎng)瓶,置于37℃、5%CO2、100%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。⑥培養(yǎng)開始2d不要晃動培養(yǎng)瓶,第3天換液,并去掉組織塊和死細(xì)胞。每1~2d換液1次,如細(xì)胞已鋪滿,按1∶2~1∶3傳代,傳3~5代的細(xì)胞可做為飼養(yǎng)層使用。1.4.2飼養(yǎng)層的制備:①取1瓶快長滿的胚胎成纖維細(xì)胞,吸掉原培養(yǎng)基,用PBS洗3次,加入含10μg/ml絲裂霉素C和10%小牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基,將培養(yǎng)瓶放回培養(yǎng)箱1.5~2h。②棄去含絲裂霉素C的培養(yǎng)基,用PBS洗5次以去除殘余的絲裂霉

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