酶的提取與分離純化

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1、第三章酶的提取與分離純化預(yù)處理（pretreatment）：包括固液分離和細(xì)胞破碎（分離胞內(nèi)產(chǎn)物）等。初步純化（roughfractionation）（提?。撼ヅc目的產(chǎn)物性質(zhì)差異很大的雜質(zhì)。高度純化（finefractionation）（精制）：除去與產(chǎn)物性質(zhì)相似的雜質(zhì)。濃縮與干燥（concentrationanddesiccation）（成品加工）:使酶與溶劑分離的過程。第一節(jié)酶的分離一、發(fā)酵液預(yù)處理(一)發(fā)酵液的相對純化1.無機離子的去除2.雜蛋白質(zhì)的去除3.色素及其他物質(zhì)的去除(二）發(fā)酵液的固液分離1.影響發(fā)酵液過濾的因素1）菌種2）培養(yǎng)基組成2.提高

2、過濾性能的方法1）絮凝和凝聚2）稀釋、加熱3）加助濾劑，常用硅藻土等。主要方法是離心分離和過濾二、細(xì)胞破碎（一）細(xì)胞壁組成細(xì)胞壁的主要成分：細(xì)菌：肽聚糖(N-乙酰萄糖胺，N-乙酰胞壁酸)酵母：葡聚糖，甘露聚糖，蛋白質(zhì)真菌:多糖（幾丁質(zhì)和葡聚糖）微生物革蘭氏陽性細(xì)菌革蘭氏陰性細(xì)菌放線菌酵母菌霉菌壁厚/nm15~5010~13同G+100~300100~250層次單層多層多層多層主要組成肽聚糖(40%~90%)多糖胞壁酸蛋白質(zhì)脂多糖(1%?2%)肽聚糖(5%~10%)脂蛋白脂多糖(11%~22%)磷脂蛋白質(zhì)葡聚糖(30%~40%)甘露聚糖(30%)幾丁質(zhì)(1%~2%

3、)蛋白質(zhì)(6%~8%)脂類(8.5%~13.5%)多聚糖(80%~90%)脂類蛋白質(zhì)各種微生物細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)與組成細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)酵母菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)M—甘露聚糖；P—磷酸二酯鍵；G—葡聚糖（二）細(xì)胞破碎的方法機械法物理法化學(xué)法生物法（酶解）1.機械法：1）液體剪切：攪拌、勻漿。2）固體剪切：研磨，珠磨，搗碎。2.物理法：1）超聲波破碎法。2）滲透壓突變法：高滲（蔗糖，高鹽等）平衡后迅速轉(zhuǎn)入低滲溶液或水中。3）凍融法：反復(fù)低溫冰凍，室溫融化。3.化學(xué)法應(yīng)用各種化學(xué)試劑與細(xì)胞膜作用，使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)改變或破壞。1）有機溶劑處理：破壞膜磷脂結(jié)構(gòu)，常用丙酮、丁醇、氯仿等。2）

4、表面活性劑處理：常用非離子型表面活性劑，如TritonX-100，Tween等。4.酶解法（enzymaticlysis）：外加酶法：根據(jù)細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和組成特點，選用適當(dāng)?shù)拿?。自溶法（autolysis）:細(xì)胞結(jié)構(gòu)在本身具有的各種水解酶作用下發(fā)生溶解的現(xiàn)象。細(xì)胞對破碎方法的敏感性細(xì)胞聲波機械滲透壓凍融————————————————————動植物++++++++++++革蘭氏陰性菌++++++++革蘭氏陽性芽孢菌++++++酵母++++革蘭氏陽性球菌+-++菌絲-++-++孢子----（三）細(xì)胞破碎確認(rèn)1.直接測定破碎前后的細(xì)胞數(shù)：破碎前，用顯微鏡或電子微粒計數(shù)

5、器直接計數(shù)；破碎后，用染色法區(qū)分破碎細(xì)胞與完整細(xì)胞。2.測定導(dǎo)電率：利用破碎前后導(dǎo)電率的變化測定破碎程度。3.測定釋放的蛋白質(zhì)量或酶活力：測定破碎液中胞內(nèi)蛋白質(zhì)或目的酶的釋放量，估算破碎率。三、酶的提取(extraction)把酶從生物組織或細(xì)胞中以溶解狀態(tài)釋放出來的過程，即將盡可能多的酶，盡量少的雜質(zhì)從原料中引入溶液。提取目標(biāo)：a.將目的酶最大限度地溶解出來。b.保持生物活性。注意：溫度升高，溶解度加大。但為防止酶失活，一般采用低溫下（0~10℃）操作。提取原則a.相似相溶。b.遠(yuǎn)離等電點的pH值，溶解度增加。提取方法：（一）鹽溶液提取常用稀鹽（常用NaCl）

6、溶液（鹽溶），對酶穩(wěn)定性好、溶解度大，最常用。（二）酸、堿溶液提?。ㄈ┯袡C溶劑提取四、離心分離（一）基本原理1.離心力Fc=mac＝mrω2＝mr（2?N/60）2N為離心機每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)（r/min）；Fc通常以相對離心力RCF（relativecentrifugalforce）表示，即離心力F的大小相當(dāng)于地球引力（重力常數(shù)g）的多少倍。一般用g（或數(shù)字?g）表示。RCF=mr（2?N/60）2/mg=1.12?10-5N2r此公式描述了相對離心力與轉(zhuǎn)速之間的關(guān)系旋轉(zhuǎn)半徑用r平均代替r平均=1/2（r大+r小）cm通常：低速離心以每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)表示，如：4000r

7、/min。高速離心（超速），常以相對離心力（RCF）表示，如：65000g。兩者可換算或查測算圖。計算近似RCF的列線圖2.沉降系數(shù):（sedimentationconstant）指單位離心力下顆粒的沉降速度（sedimentationvelocity）,用S表示。由于許多生物大分子的S值很小，所以定義10?13s為一個沉降單位，1S=1?10?13s。常用S表示某些生物大分子、亞細(xì)胞及亞細(xì)胞器的大小，如16sRNA，蛋白質(zhì)的沉降系數(shù)一般在1~200之間。（二）離心機的種類按離心機轉(zhuǎn)速的不同，分為：常速（低速）高速超速名稱轉(zhuǎn)速(r/min)注意事項低速離心機?8

8、000常溫，注意樣品熱變