糞便細(xì)菌學(xué)規(guī)范

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1、糞便細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)操作規(guī)范實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢查是細(xì)菌培養(yǎng)，沙門氏菌、志賀氏菌、鄰單胞菌和氣單胞菌、副溶血性弧菌、致瀉性大腸桿菌作為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)培養(yǎng)的主要腹瀉病原菌。一、標(biāo)本采集與運(yùn)送：1．標(biāo)本采集（1）標(biāo)本采集盡可能在發(fā)病早期和應(yīng)用抗菌藥物治療之前。在不同的時(shí)間采集2~3份標(biāo)本可以提高致病菌的分離率。（2）自然排便采集糞便標(biāo)本時(shí)，取有膿血、粘液、組織碎片部分的糞便1～3g。液體糞便則取絮狀物，一般取1～3ml，直接裝入糞便容器或保存液或運(yùn)送培養(yǎng)基中送檢。（3）直腸拭子采集糞便標(biāo)本，檢查帶菌者時(shí)可以采取肛拭（棉拭先用保存液或增菌培養(yǎng)基濕潤(rùn)），深入肛門內(nèi)7~10

2、cm除采樣，不能及時(shí)接種時(shí)，應(yīng)將標(biāo)本放入保存液內(nèi)。(4)容器應(yīng)清潔、帶蓋、廣口的（不宜使用紙盒）、送檢的標(biāo)本中不能加入防腐劑。2．標(biāo)本運(yùn)送（1）糞便標(biāo)本應(yīng)盡快送檢，室溫條件下不能超過2h。如不能及時(shí)送檢可加入pH7.0的磷酸鹽甘油或轉(zhuǎn)運(yùn)培養(yǎng)基，但不宜超過24h。使用改良Cary-Blair培養(yǎng)基時(shí)，不能運(yùn)送培養(yǎng)志賀氏菌的標(biāo)本。（2）直腸拭子采集的標(biāo)本必須置入運(yùn)送培養(yǎng)基或GN肉湯中送檢，轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間不宜超過2h。（3）高度懷疑霍亂弧菌感染的標(biāo)本運(yùn)送必須符合特殊標(biāo)本的安全要求。（4）直腸活檢標(biāo)本用糞便容器送檢，內(nèi)盛少量無菌蒸餾水以防止沉淀。3．標(biāo)本保存不

3、能及時(shí)檢驗(yàn)的標(biāo)本通常4-6℃保存，用磷酸緩沖鹽甘油溶液保存培養(yǎng)沙門氏菌和志賀氏菌的標(biāo)本，保存培養(yǎng)彎曲桿菌和弧菌的標(biāo)本，需加CaCl2(100mg/L)。二、標(biāo)本鏡檢糞便標(biāo)本直接鏡檢找到大量多核白細(xì)胞，提示侵襲性致病菌感染。如果是由腸道菌群紊亂引起的腹瀉，革蘭氏染色結(jié)果可以提示是酵母菌還是葡萄球菌感染。2.?革蘭氏染色制備一張薄的糞便涂片，采用常規(guī)革蘭氏染色方法。鏡下觀察是否有大量WBCs，成叢的革蘭氏陽性球菌，酵母菌。3.水樣糞便的標(biāo)本，采用懸滴法暗視野（或相差顯微鏡）鏡檢，如發(fā)現(xiàn)細(xì)菌呈穿梭狀極活潑的運(yùn)動(dòng)，則考慮為弧菌感染。加入O1群霍亂弧菌診斷

4、多價(jià)血清或O139血清，顯微鏡下觀察若運(yùn)動(dòng)停止則為抑動(dòng)試驗(yàn)陽性。采用懸滴法鏡檢發(fā)現(xiàn)投鏢式或螺旋式運(yùn)動(dòng)的細(xì)菌，革蘭陰性弧形、S形或螺旋形的小桿菌，提示彎曲桿菌感染。三、細(xì)菌培養(yǎng)及培養(yǎng)基的選擇1．腹瀉病原菌常規(guī)培養(yǎng)對(duì)患者糞便標(biāo)本進(jìn)行腹瀉病原菌常規(guī)培養(yǎng)，包括沙門氏菌、志賀氏菌、致瀉性大腸桿菌、鄰單胞菌、氣單胞菌，致病性弧菌。此外，也包括可引起菌群失調(diào)的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和酵母菌。糞便標(biāo)本至少應(yīng)接種血平皿、HE（XLD或SS）、EMB（或MAC或中國(guó)蘭）等培養(yǎng)基。沿海地區(qū)還需增加TCBS瓊脂培養(yǎng)基。補(bǔ)充說明：（1）SS培養(yǎng)基對(duì)部分志賀氏菌有抑制

5、作用。（2）常用的腸道選擇性培養(yǎng)基（如SS等）對(duì)氣單胞菌、鄰單胞菌有抑制作用，初次分離時(shí)應(yīng)接種血平皿和MAC。（3）若用EMB（伊紅美蘭）、MAC（麥康凱）等培養(yǎng)基培養(yǎng)后，未檢出常見致病菌，但感染性腹瀉癥狀明顯，可重新采集糞便標(biāo)本接種GN肉湯，35℃培養(yǎng)4-6h，再轉(zhuǎn)種HE（腸道瓊脂）等培養(yǎng)基，進(jìn)一步分離培養(yǎng)。（4）如懷疑沙門氏菌感染，可先用SF肉湯（亞硒酸鹽增軍液），以提高檢出率。（5）正常人體腸道內(nèi)可以存在金黃色葡萄球菌，因此只有每克糞便細(xì)菌數(shù)達(dá)到105CFU時(shí)才有臨床意義。（6）氣單胞菌能夠在常規(guī)的鑒別培養(yǎng)基如MAC和EMB上生長(zhǎng)，但選擇性

6、培養(yǎng)基更有助于檢出氣單胞菌。選擇性培養(yǎng)基：每10ml的BAP（血瓊脂平板）培養(yǎng)基加入10mg氨芐西林（BAP-AMP）。（7）鄰單胞菌可以在一些常規(guī)鑒別培養(yǎng)基如MAC或HE生長(zhǎng)，但選擇性培養(yǎng)基更有助于檢出鄰單胞菌。選擇性培養(yǎng)基：IBB瓊脂（肌醇-亮綠-膽鹽瓊脂）。2．腹瀉病原菌的增菌培養(yǎng)早期培養(yǎng)物傳代培養(yǎng)后使用增菌肉湯培養(yǎng)，能提高低數(shù)量菌的檢出率。常用增菌液有：GN肉湯：用于沙門氏菌和志賀氏菌的增菌培養(yǎng)，嚴(yán)格保證培養(yǎng)4-6h后即進(jìn)行傳代。SF肉湯：主要用于沙門氏菌的增菌培養(yǎng)，經(jīng)36℃培養(yǎng)24h后，接種鑒別培養(yǎng)基進(jìn)行分離培養(yǎng)。TT肉湯：主要用于沙門

7、氏菌的增菌培養(yǎng)，但不包括傷寒沙門氏菌和副傷寒沙門氏菌，培養(yǎng)12h后盡快傳代。堿性蛋白胨水：主要用于弧菌增菌，35-37℃培養(yǎng)5-8h后，傳代到TCBS平板上培養(yǎng)。四、培養(yǎng)物鑒定1、志賀氏菌的鑒定志賀氏菌屬包括4個(gè)種即痢疾志賀氏菌（S.dysenteriae）、福氏志賀氏菌（S.flexneri）、鮑氏志賀氏菌（S.boydii）、宋內(nèi)氏志賀氏菌（S.sonnei）。志賀氏菌血清學(xué)分群分為A、B、C、D四群。目前，A群含有15個(gè)血清型，B群含有8個(gè)血清型（前5個(gè)血清型又進(jìn)一步分為11個(gè)亞型），C群含有19個(gè)血清型，D群只含有1個(gè)血清型。對(duì)于腸道培養(yǎng)

8、基上可疑為志賀氏菌的菌落，首選鑒定試驗(yàn)：賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)、動(dòng)力試驗(yàn)、葡萄糖產(chǎn)氣試驗(yàn)、粘液酸鹽試驗(yàn)、克氏檸檬酸鹽試驗(yàn)、乙酸鹽實(shí)驗(yàn)。志賀氏菌