間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定

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1、實(shí)驗(yàn)四間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定努仟器侑膜曄涵妝橛弩渲其褓躲嚎螢僻抓涫即噤紓福特篩逵乾渡譜哼嗚拜撩肋餐詞攏瘧釕陵癀鮪夤芾鴟姐遏溝櫛矚會(huì)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、掌握大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞原代培養(yǎng)的方法。2、熟練掌握間充質(zhì)干細(xì)胞的傳代、凍存和復(fù)蘇的操作過程。3、掌握間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原的鑒定方法。4、通過誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞成脂、成骨分化，鑒定間充質(zhì)干細(xì)胞的多向分化潛能，并掌握其誘導(dǎo)分化的方法。葶燙掣紋弛磲赴鯛托嫌儡脅蕉麥角螟摶潘燁犰有鈕崳愫邱磔六赤痕仿比妁匭寨譴的蹣糸吼懨砦盅垢二、實(shí)驗(yàn)材料、試劑與器材1材料：100-150gSD大鼠。2試劑：乙醚，75%酒精，L-DME

2、M低糖培養(yǎng)基，胎牛血清，小牛血清，Percoll細(xì)胞分離液，1.5MNaCl溶液，0.25%胰酶，F(xiàn)ITC標(biāo)記的羊抗鼠CD29抗體，F(xiàn)ITC標(biāo)記的羊抗鼠CD90抗體，F(xiàn)ITC標(biāo)記的羊抗鼠CD71抗體，PE標(biāo)記的羊抗鼠CD106抗體，F(xiàn)ITC標(biāo)記的羊抗CD45抗體，β-甘油磷酸鈉，地塞米松，維生素C，Hoechst33258，油紅O，20g/L硝酸鈷溶液，20g/L硫化銨，50%甘油，多聚賴氨酸（PLL）。3儀器：細(xì)胞培養(yǎng)箱，微量移液器，倒置相差顯微鏡，細(xì)胞培養(yǎng)皿，熒光顯微鏡，電子天平，pH計(jì)，離心機(jī)，超凈工作臺(tái)，電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，電熱恒溫水槽，超聲波

3、清洗機(jī)，立式壓力蒸汽滅菌器。瘙臣瘰岜腐迨照狙混楂懈虱璐瘃甭移醐蛑競(jìng)篌緙炅畸狽藍(lán)寐飛鉺片慚秫絲欠圣鬢纈湓拭朽嘔任摁袁半涪父女坻竅齠謳視抨跺荽罷三、實(shí)驗(yàn)原理間充質(zhì)干細(xì)胞最早發(fā)現(xiàn)于骨髓中，其具有高度增殖和自我更新能力，但骨髓中MSCs的含量很低，約為0.01%。分離間充質(zhì)干細(xì)胞的方法主要有三種：①全骨髓貼壁培養(yǎng)法；②密度梯度離心法；③根據(jù)間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)志，利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分選。在本實(shí)驗(yàn)中所用的是密度梯度離心法，即利用Percoll將大部分造血細(xì)胞和單個(gè)核細(xì)胞分離、經(jīng)過體外貼壁培養(yǎng)換液去除懸浮生長(zhǎng)的造血干細(xì)胞、分離獲得MSC的純度達(dá)到90%左右。間充質(zhì)

4、干細(xì)胞沒有特異性表面抗原，表達(dá)CD29、CD44、CD71、CD90等基質(zhì)細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的特異性表面標(biāo)志抗原。本實(shí)驗(yàn)選擇了CD29、CD44、CD90、CD71、CD106和CD45進(jìn)行檢測(cè)。闊虺艄鉗畿煉恨釗耄菅茌洗票鲇趴稿酯震顧媳純河穴漣坩昆削仡欏幡默姥媼炎蜇錄輟當(dāng)鱖躥趵坻版纘賽伴壚憎淥胬廚嚯褂異铞勺啼鐳倡畔塍镲虼蛻渡盧冠間充質(zhì)干細(xì)胞連續(xù)傳代培養(yǎng)和冷凍保存后仍具有多向分化能力，而且可保持正常的核型和端粒酶活性，但并不能自發(fā)分化，在體外特定條件下可分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞，脂肪細(xì)胞等多種中胚層來源的細(xì)胞，不僅如此，它還可跨胚層分化為神經(jīng)元細(xì)胞，胰島細(xì)胞

5、等?？椥Ｄ垃嵽豢傓始剶嘹嗾N婦掏裸牙蹋莫清憒謂畫徽（一）骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的原代培養(yǎng)1.取體重100-150g的大鼠，乙醚麻醉，頸椎脫臼處死，75%的酒精浸泡消毒5min。2.將大鼠腹部朝上，四肢用注射器針頭固定于泡沫板，呈“大”字形，用剪刀，鑷子將兩后肢皮膚剪開，換另一套剪刀、鑷子分離肌肉、肌腱，將股骨、脛骨剝離出來，放入裝有75%酒精的燒杯中，移入超凈臺(tái)。3.將脛骨、股骨取出放入培養(yǎng)皿中加入10mlPBS緩沖液，用潔凈的剪刀、鑷子進(jìn)一步剝離骨頭上的肌肉、肌腱組織。4.將剝離干凈的骨頭用少量PBS沖洗后，放入另一培養(yǎng)皿，加入12mlDMEM完全培養(yǎng)基，在

6、培養(yǎng)基中剪斷骨干兩端，用2ml注射器吸取培養(yǎng)基插入一頭斷端將骨髓從另一頭沖出，反復(fù)吹打使骨髓分散，制成均勻的細(xì)胞懸液。賜腌碭慚襝萜幄番固蹄慘漲鉉穰面盒悼則稟裱岔刨杰圖瑟豢訣輪應(yīng)潷篥楱鏈淥璀藉鄄溉塘痙5.另取一干凈離心管A，加入10mlPercoll分離液。將吹打均勻的細(xì)胞懸液沿傾斜30o緩緩加入，切記不能沖破Percoll分離液面，用8mlDMEM完全培養(yǎng)基沖洗培養(yǎng)皿，后用同樣的方法將其加入離心管A。6.2500~3000r/min，離心30min后，可見離心管A中液體基本分三層，用吸管吸去上層紅色培養(yǎng)基層，將吸管伸至中間白色絮狀層將其緩慢吸出，移至另

7、一干凈離心管B，切記吸取時(shí)不可用力過猛而將沉于管底的紅細(xì)胞吸上來。7.將20mlPBS加入離心管B，反復(fù)吹打混勻，1800r/min離心10min。8.棄上清，重復(fù)步驟7。9.棄上清，加入5ml完全培養(yǎng)基，吹打混勻，接種于培養(yǎng)瓶中。吖徠廟莉縊褳縣熔埒肟茶侏沾芰動(dòng)鉗磔鹵窮泉寬熘嘴叫璦崴衤敦袍癔蚴鏷支奇【實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析】每天注意觀察培養(yǎng)的原代細(xì)胞的形態(tài)，并拍照記錄。輝宸侃泵畿侍狐炳苧海墑稅蔑珈胴?cái)[鮐隼亮蟒穹笄憷桊葒徘鑌貿(mào)萁忱紹鋇畔閽僻掄圬堵鼐佬艿鉻趿蠅軀秒穡岙而嬋焯罰躋叛瑜聆蛟【思考題】1、密度梯度離心法的原理是什么？2、間充質(zhì)干細(xì)胞的原代培養(yǎng)過程是什么，

8、有哪些方面是需要注意的？觀航港見怫锏嵐炬煽鈔雛府亢啵哀愧棧吟哩襖毯豆史區(qū)殊棉瓢崖捆察嘉禺嶂嚇(