iCycler iQ熒光定量PCR儀的操作說明

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1、iCycleriQTM熒光實時多波長PCR檢測系統(tǒng)操作說明iCycleriQTMMulti-ColorRealTimePCRDetectionSystemOperatingInstructionsCatalogNumber170-8740如與英文版說明書有不符之處以英文版說明書為準12．iCycleriQTM熒光實時多波長PCR檢測系統(tǒng)操作速成2.1簡介：iCycleriQTM熒光實時多波長PCR檢測系統(tǒng)可以最多一次檢測96個樣品，且每個樣品中同時可以檢測4個不同波長的熒光信號。也就是說，只要標記不同熒光探針，iCycler

2、可以對同一個孔中兩種以上的PCR產物（最多四種）同時進行實時分析。這樣對多重PCR反應或使用內對照（InternalControl）定量的PCR反應的檢測就十分方便。在反應過程中，不同的熒光信號通過與其匹配的不同波長的濾光鏡組來檢測。比如，在一個反應管中同時有四種熒光探針共存，分別標記了FAM、HEX、?TMTexasRed和Cy5，在收集其熒光信號數(shù)據的時候，必須同時使用FAM濾光鏡組、HEX濾光鏡組、TexasRed濾光鏡組和Cy5濾光鏡組。所有的收集的信號由iCycler的軟件進行分析整理，在PCR反應結束后，該軟件可

3、以顯示其各自的熒光曲線和標準曲線，并得到這四種熒光探針分別對應的靶DNA的定量結果。在每次使用iCycler進行PCR熒光定量實驗之前，系統(tǒng)必須獲得孔間差異因子（WellFactor）和純染料校準（PureDyeCalibration）的數(shù)據。系統(tǒng)通過這些數(shù)據來區(qū)分不同的熒光信號，矯正孔間的誤差。本章節(jié)將詳細的介紹這兩者的調節(jié)方法。您在使用本儀器前請先仔細閱讀本章的內容，這將有助于您能夠快速地完成實驗并獲得理想的實驗數(shù)據。2.2：iCycler操作速成1.開機前先讓攝象系統(tǒng)預熱30分鐘。接通iCycler的電源，并連上電腦，

4、打開iCycler的軟件。如果本儀器在上次使用后被搬動過，請在RunTimeCentral模塊中的ImagingService窗口檢查遮光框的校正情況，詳見6.2。2.如果要使用新的熒光染料/濾光鏡組，必須進行一次純染料校準（PureDyeCalibration），使系統(tǒng)獲得相關數(shù)據，詳見2.4。3.在96孔薄壁反應板（96-wellThinWallplate，產品序列號223-9441）內加入PCR反應試劑和待測樣本。完成后在反應板上蓋一塊光學級封帶（OpticalQualitysealingtape，產品序列號223-9

5、444），用封帶涂抹器（塑料扁平齒）2將其涂抹光滑。注意，無論帶不帶手套，都不要讓手指接觸到封帶表面。完成后撕去封條四周的白條。如果不用96孔薄壁PCR反應板，而是用單獨的PCR反應管或八連管時，請在加完樣品后蓋上相匹配的蓋子。注意，為防止放入iCycler的PCR反應管被壓碎，在使用綠色抗凝環(huán)（greenanticondensationring）時至少放8個反應管；如果沒有使用該環(huán)，則至少要加14個反應管。4.在ProtocolWorkshop模塊中設置PCR熱循環(huán)的程序（thermalprotocol），包括溫度、時間、

6、循環(huán)次數(shù)等參數(shù)的設置。詳見5.1。5.在ProtocolWorkshop模塊中設置反應板設置文件（PlateSetup）。先創(chuàng)建一個新的反應板設置文件，再根據本次實驗的所用的熒光染料選擇其對應的濾光鏡設置文件（FliterWheelSetupfile），詳見5.2.5。最后，在設置窗口的96孔模擬布局圖中選擇本次實驗使用哪些孔、樣品類型（sampletype）以及要檢測的熒光基團種類。如果樣品類型是標準品的話，還要輸入其對應的量。全部完成后再點擊“ViewPlateSetup”鍵，進行確認。詳見5.2。6.確認上一步中選擇的

7、濾光鏡組是否就位。詳見5.2.5。7.如果實驗需要使用孔間差異矯正板（externalwellfactorplate）進行系統(tǒng)孔間差異矯正的，先將該板放入iCycler；如果是使用反應板內部矯正的，直接將步驟3中準備好的PCR反應板放入iCycler。詳見2.3。在ProtocolLibrary模塊中“ViewProtocol”窗口選擇PCR熱循環(huán)文件；同樣在該模塊的“ViewPlateSetup”窗口選擇反應板設置文件。完成后按“Run”鍵。8.隨后系統(tǒng)自動切換到“RunPrep”窗口，用戶在此確認PCR熱循環(huán)文件和反應板

8、設置文件是否正確。在“Samplevolumeis”文件框中輸入反應體系的體積；根據本次實驗內容在“IdentifyProtocolAnalysis”中選擇是PCR定量/熔點曲線（PCRQuantification/MeltCurve）還是純染料校準（PureDyeCalibration）