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《近紅外熒光成像技術(shù)——定量Western Blot的新標(biāo)準(zhǔn)》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、近紅外熒光成像技術(shù)-定量WesternBlot的新標(biāo)準(zhǔn)基因有限公司李春燕化學(xué)發(fā)光檢測近紅外熒光檢測680laser800laser11/10/2012化學(xué)發(fā)光檢測紅外熒光檢測?酶促化學(xué)反應(yīng)，無法準(zhǔn)確定量?信號恒定，準(zhǔn)確定量?暗房曝光?熒光成像?膜上無法直接觀察到Marker?膜上直接觀察到Marker?兩種蛋白檢測需Strip?兩種蛋白同時檢測11/10/2012近紅外熒光成像技術(shù)?熒光——準(zhǔn)確定量、線性范圍寬廣?紅外——背景低、信噪比高?雙色——同時檢測、同時輸出熒光－準(zhǔn)確定量化學(xué)發(fā)光熒光?動態(tài)信號－信號隨時間變化?靜態(tài)信號－信號不隨時間變化?信號不與目標(biāo)蛋白
2、濃度成比例關(guān)系?信號和目標(biāo)蛋白濃度成比例關(guān)系SaturationINTENSITYBackground0,00,0TIMETIMEHighconcentration/Mediumconcentration/Lowconcentration/signalsignalsignal紅外熒光VS化學(xué)發(fā)光定量線性范圍更寬化學(xué)發(fā)光法近紅外熒光法?近紅外熒光法能檢測到0.6pg的蛋白（靈敏度高）?近紅外熒光成像呈現(xiàn)一個很好的線性（定量準(zhǔn)確）MooseImaging–Signal/BackgroundBackgroundHighS/BLowS/B近紅外：低背景，高信噪比近紅外熒
3、光的波長范圍在700-800nm之間，避開了NC膜、PVDF膜微孔板等耗材的本底信號，提高了檢測的信噪比和相對靈敏度11/10/2012紅外熒光－直接檢測Infrareddye(IRD800,Alexa680)膜上抗原一抗結(jié)合紅外標(biāo)記的二抗Odyssey直接掃描?不需要底物?不需要底片/暗室?信號持久Odyssey—雙色同時檢測?兩套獨立激發(fā)檢測系統(tǒng)?700通道：680nm激發(fā)720nm檢測?800通道：780nm激發(fā)820nm檢測800nm700nmOverlay雙色－定量western檢測TargetproteinAnti-rabbit800channelN
4、ormalizertargetAnti-mouse700channel雜交條件均等，結(jié)果同時輸出，直接比對11/10/2012雙色－蛋白磷酸化—+EGF—+EGF—+EGF800nm700nm700and800channelchannelnmERKphosphoERKResultsOverlaidEGF刺激后A431細胞，ERK1andERK2(p44/42MAPkinases)磷酸化情況,一抗分別是兔抗ERK抗體和小鼠抗磷酸化ERK抗體,二抗用抗兔的IRDye800標(biāo)記的抗體(green),和抗鼠的Alexa680標(biāo)記的抗體(red)。疊加后為黃色，黃色的深淺
5、即代表了磷酸化水平的高低，并且可以通過軟件進行準(zhǔn)確的量化分析。NIREMSA-告別同位素！（體外核酸和蛋白相互作用）700nmChannel700and800OverlayDNA-ProteinComplexUnboundDNAIRDye800800nmChannelUnboundDNAIRDye700BindingofT7RNAPtotwoDNAfragmentscontainingtheT7promotersequence,labeledwitheitherIRDye700(red)orIRDye800(green).11/10/2012In-CellWes
6、ternAssay細胞處理效果和藥物篩選的最佳選擇In-CellWesternAssay快速、高通量、重現(xiàn)性好膜上WesternIn-CellWestern細胞培養(yǎng)√√細胞刺激√√固定和透化√細胞裂解√上樣√電泳√轉(zhuǎn)膜√孵育抗體√√成像√√通量12sample/Gel96或384/Plate11/10/2012NIR-小動物活體成像低GFPRFPIRDye?高背信景噪比?組織和細胞對近紅外波長的光信號吸收最低?紅外波段，光的散射更低?在近紅外波長范圍，自發(fā)熒光更低11/10/2012波長特異性激光器作為激發(fā)光源SourceExcitationQualityExc
7、itationBackgroundOverallLightofLightEfficiencyNoisePerformance800nm800nm800nm800nm800nm800nmNIRLaserLowerMoreLightBetterCleanerBetterBenefitPowerExcitationDetectionSensitivityEfficiencyLEGENDAbsorptionSpectraofDyeEmissionSpectraofDyeLightSpectra(Source)NoisePearl活體成像流程簡單Customlabelin
8、gEGF-IRDye80
