熒光定量PCR應(yīng)用

《熒光定量PCR應(yīng)用》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。

1、實(shí)時熒光定量pcr儀請用一段簡單的話描述該詞條，馬上添加摘要。實(shí)時熒光定量PCR儀＋實(shí)時熒光定量試劑+通用電腦+自動分析軟件，構(gòu)成PCR-DNA/RNA實(shí)時熒光定量檢測系統(tǒng)。?實(shí)時熒光定量pcr儀-1、實(shí)時熒光定量PCR的優(yōu)勢：???設(shè)備由熒光定量系統(tǒng)和計算機(jī)組成，用來監(jiān)測循環(huán)過程的熒光。與實(shí)時設(shè)備相連的計算機(jī)收集熒光數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)通過開發(fā)的實(shí)時分析軟件以圖表的形式顯示。原始數(shù)據(jù)被繪制成熒光強(qiáng)度相對于循環(huán)數(shù)的圖表。原始數(shù)據(jù)收集后可以開始分析。實(shí)時設(shè)備的軟件能使收集到的數(shù)據(jù)進(jìn)行正常化處理來彌補(bǔ)背景熒光的差

2、異。正?；罂梢栽O(shè)定域值水平，這就是分析熒光數(shù)據(jù)的水平。樣品到達(dá)域值水平所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)稱為Ct值（限制點(diǎn)的循環(huán)數(shù)）。域值應(yīng)設(shè)定在使指數(shù)期的擴(kuò)增效率為最大，這樣可以獲得最準(zhǔn)確，可重復(fù)性的數(shù)據(jù)。如果同時擴(kuò)增的還有標(biāo)有相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，線性回歸分析將產(chǎn)生一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以用來計算未知樣品的濃度。實(shí)時熒光定量pcr儀-2、實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)原理所謂real-timeQ-PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基因，利用熒光信號累積實(shí)時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。在

3、real-time技術(shù)的發(fā)展過程中，兩個重要的發(fā)現(xiàn)起著關(guān)鍵的作用：（1）在90年代早期，TaqDNA多聚酶的5′核酸外切酶活性的發(fā)現(xiàn)，它能降解特異性熒光記探針，因此使得間接的檢測PCR產(chǎn)物成為可能。（2）此后熒光雙標(biāo)記探針的運(yùn)用使在一密閉的反應(yīng)管中能實(shí)時地監(jiān)測反應(yīng)全過程。這兩個發(fā)現(xiàn)的結(jié)合以及相應(yīng)的儀器和試劑的商品化發(fā)展導(dǎo)致real-timeQ-PCR方法在研究工作中的運(yùn)用。???????????PCR反應(yīng)過程中產(chǎn)生的DNA拷貝數(shù)是呈指數(shù)方式增加的，隨著反應(yīng)循環(huán)數(shù)的增加，最終PCR反應(yīng)不再以指數(shù)方式生

4、成模板，從而進(jìn)入平臺期。在傳統(tǒng)的PCR中，常用凝膠電泳分離并用熒光染色來檢測PCR反應(yīng)的最終擴(kuò)增產(chǎn)物，因此用此終點(diǎn)法對PCR產(chǎn)物定量存在不可靠之處。在real-timeQ-PCR中，對整個PCR反應(yīng)擴(kuò)增過程進(jìn)行了實(shí)時的監(jiān)測和連續(xù)地分析擴(kuò)增相關(guān)的熒光信號，隨著反應(yīng)時間的進(jìn)行，監(jiān)測到的熒光信號的變化可以繪制成一條曲線。在PCR反應(yīng)早期，產(chǎn)生熒光的水平不能與背景明顯地區(qū)別，而后熒光的產(chǎn)生進(jìn)入指數(shù)期、線性期和最終的平臺期，因此可以在PCR反應(yīng)處于指數(shù)期的某一點(diǎn)上來檢測PCR產(chǎn)物的量，并且由此來推斷模板最初的

5、含量。為了便于對所檢測樣本進(jìn)行比較，在real-timeQ-PCR反應(yīng)的指數(shù)期，首先需設(shè)定一定熒光信號的域值，一般這個域值（threshold）是以PCR反應(yīng)的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號（baseline），熒光域值的缺省設(shè)置是3～15個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。如果檢測到熒光信號超過域值被認(rèn)為是真正的信號，它可用于定義樣本的域值循環(huán)數(shù)（Ct）。Ct值的含義是：每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達(dá)到設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。研究表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，

6、起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，因此只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。實(shí)時熒光定量pcr儀-3、實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)在醫(yī)療方面的應(yīng)用⑴病原體檢測：目前，采用熒光定量PCR檢測技術(shù)可以對淋球菌、沙眼衣原體、解脲支原體、人類乳頭瘤病毒、單純皰疹病毒、人類免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、結(jié)核分枝桿菌、EB病毒和巨細(xì)胞病毒等病原體進(jìn)行定量測定。與傳統(tǒng)的檢測方法相比具有靈敏度高、取樣少、快速簡便等優(yōu)點(diǎn)。如：結(jié)核菌基因診斷的意義主要表現(xiàn)

7、在：a.區(qū)分TB與其它分枝桿菌；b.檢測TB耐藥基因；c.提高TB的陽性檢出率。⑵產(chǎn)前診斷：到目前為止，人們對遺傳性物質(zhì)改變引起的遺傳性疾病還無法治療，只能通過產(chǎn)前監(jiān)測，減少病嬰出生，以防止各類遺傳性疾病的發(fā)生，如為減少X連鎖遺傳病患兒的出生，從孕婦的外周血中分離胎兒DNA，用實(shí)時熒光定量PCR檢測其Y性別決定區(qū)基因是一種無創(chuàng)傷性的方法，易為孕婦所接受。⑶藥物療效考核：對乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)定量分析顯示：病毒量與某些藥物的療效關(guān)系。HCV高水平表達(dá)，干擾素治療作用不敏感，而

8、HCV低滴度，干擾素作用敏感；在拉米夫定治療過程中，HBV-DNA的血清含量曾有下降，隨后若再度上升或超出以前水平，則提示病毒發(fā)生變異。如PCR技術(shù)在HBV檢測中的應(yīng)用及意義：a.了解乙肝病毒在體內(nèi)存在的數(shù)量。b.是否復(fù)制。c.是否傳染，傳染性有多強(qiáng)。d.是否有必要服藥。e.肝功能異常改變是否由病毒引起。f.判斷病人是適合用哪類抗病毒藥物。g.判斷藥物治療的療效。⑷腫瘤基因檢測：盡管腫瘤發(fā)病的機(jī)理尚未清楚，但相關(guān)基因發(fā)生突變是致癌性轉(zhuǎn)變的根本原因已被廣泛接受。癌基因的