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《胃癌細胞中調(diào)控NGAL基因表達的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子鑒定》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、http://www.paper.edu.cn1胃癌細胞中調(diào)控NGAL基因表達的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子鑒定1,221,21,2321,2袁華敏，許麗艷，常靜霞，張發(fā)仁，杜則澎，蔡唯佳，呂琢，1李恩民1汕頭大學醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室，汕頭(515041)2汕頭大學醫(yī)學院腫瘤病理研究室，廣東省免疫病理重點實驗室，汕頭(515041)3汕頭大學理學院生物系，汕頭(515063)E-mail：nmli@stu.edu.cn摘要：本文主要探討了胃癌組織細胞中NGAL基因的表達及其分子調(diào)控機制。免疫組織化學染色顯示，NGAL蛋白在不同分化程度的胃腺癌中呈陽性表達，而在正常胃腺上皮組織中呈陰性表達
2、；在胃癌細胞系BGC-823和SGC-7901中，NGAL分別呈強陽性和弱陽性表達。雙熒光素酶報告基因檢測顯示，在胃癌細胞BGC-823中NGAL基因啟動子區(qū)核心調(diào)控元件位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游-110~-79；而進一步的突變和缺失分析確認，其間的-85~-79是轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的關(guān)鍵位點。生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，-85~-79區(qū)段是AP1轉(zhuǎn)錄因子家族成員結(jié)合位點。而進一步的RT-PCR發(fā)現(xiàn)，BGC-823細胞中有多種AP1家族成員的表達。推測AP1家族成員可能是胃癌細胞中NGAL基因表達的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。關(guān)鍵詞：NGAL，胃癌，轉(zhuǎn)錄因子，AP1家族中圖分類號：Q784；R735.11.引言N
3、GAL（neutrophilgelatinase—associatedlipocalin）基因蛋白編碼產(chǎn)物，即中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白，是1993年Kjeldsen等人在研究中性粒細胞的明膠酶（gelatinaseB，[1]即MMP-9）時首先發(fā)現(xiàn)的。十多年來的研究表明，NGAL與炎癥、免疫反應(yīng)、細胞分化、細胞凋亡、組織重構(gòu)以及多種腫瘤的發(fā)生與發(fā)展等過程相關(guān)；而NGAL基因表達已被當作[2]一種早期的、靈敏的、非損傷性的標記物，用于腎缺血及腎毒性損傷監(jiān)測。另外在動脈粥樣硬化斑塊、心肌梗塞以及家族性淀粉樣變等組織中，可見NGAL基因表達增高，推測可[3,4]能參與了粥樣硬化斑塊
4、以及梗塞的心肌組織等的降解重塑過程。最近有研究報道，NGAL[5]基因表達還可以作為氧應(yīng)激的生物標記。而近年來的一些研究發(fā)現(xiàn)，NGAL基因在結(jié)腸癌、乳腺癌、胰腺癌、肺癌、皮膚癌以及食管癌等腫瘤細胞中表達明顯升高，可能參與了癌細胞[6-13]的侵襲移動。胃癌是世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤之一。據(jù)統(tǒng)計,全球每年約有60余萬人[14]因胃癌死亡,位居癌癥死因的第2位。迄今，NGAL基因在胃癌中是否有表達尚未見報道。另外，有關(guān)NGAL基因表達調(diào)控方面的研究，主要見于以下幾篇報道。首先Numata等人研究發(fā)現(xiàn)，在G-CSF誘導(dǎo)骨髓細胞32Dc13（IL3依賴的小鼠骨髓細胞clone3）分化為中[1
5、5]性粒細胞時，轉(zhuǎn)錄因子C/EBPα可直接激活NGAL基因表達。Cowland等人研究發(fā)現(xiàn)，在Ⅱ型肺泡上皮細胞A549培養(yǎng)液中，加入細胞因子IL－1β可誘導(dǎo)NGAL基因表達上調(diào)10倍以上，而啟動子區(qū)內(nèi)的NF-κB結(jié)合位點及其臨近序列被預(yù)測為可能是調(diào)控NGAL基因表達[16]的關(guān)鍵元件之一。而在此基礎(chǔ)上，最近，Cowland等人又進一步研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子[17]NF-κBζ在IL-1β上調(diào)NGAL基因表達中發(fā)揮著輔助作用。為了探討NGAL基因在胃癌組織細胞中是否表達及其分子調(diào)控機制，在本文中，我們首先利用免疫組化和WesternBlotting等技術(shù)，檢測了NGAL基因在胃腺癌組織
6、以及胃癌細胞系中的表達情況，然后通過聯(lián)合運用漸進式截短缺失、堿基突變、雙熒光素報告基因檢測和1本課題得到國家自然科學基金面上項目（30672376,30570849,30370641），中國高等教育博士科研基金項目（20050560002,20050560003）和廣東省自然科學基金重點項目（37788,05104541）的資助。-1-http://www.paper.edu.cnRT-PCR等實驗方法，結(jié)合生物信息學分析等研究確定，在胃癌細胞中，NGAL基因啟動子區(qū)的核心元件位于-85～-79位點,而關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子可能是AP1家族中的成員。2.材料方法2.1細胞培養(yǎng)胃癌細胞系，B
7、GC-823和SGC-7901，分別在含10%小牛血清的199培養(yǎng)液（Invitrogen公司）和DMEM培養(yǎng)液（Invitrogen公司）中貼壁生長。CO2濃度是5%。培養(yǎng)溫度37℃。細胞用含0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA的消化液消化傳代。2.2載體構(gòu)建將人類NGAL基因5’側(cè)翼調(diào)控區(qū)不同片段（-1431~+84）分別插入到熒光素酶報告基因載[18]體pGL3-Basic（Promega）中，詳細構(gòu)建過程見參考文獻。本實驗中選用的重組質(zhì)粒包括pB
