細胞原代培養(yǎng)與傳代

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1、目錄細胞培養(yǎng)基本概念細胞培養(yǎng)基本要求細胞培養(yǎng)基本技術(shù)細胞培養(yǎng)定義定義：模擬機體內(nèi)生理條件，將細胞從機體中取出，在人工條件下使其生存、生長、繁殖和傳代，進行細胞生命過程、細胞癌變、細胞工程等問題的研究。優(yōu)點：1．活細胞：同時、大量、均一性、重復性；2．可控制：各種物理、化學、生物等因素可調(diào)控；3．研究方法多樣：倒置、熒光、電子、激光共焦顯微鏡、流式細胞術(shù)、免疫組織化學、原位雜交、同位素標記；4．應用廣：不同物種、不同年齡、不同組織、正常或異常（腫瘤）；缺點：人工所模擬的條件與體內(nèi)實際情況仍不完全相同；當細胞被置于體外培養(yǎng)后，生活在缺乏動態(tài)平衡的環(huán)

2、境中，時間久了，必然發(fā)生變化。細胞培養(yǎng)的基本概念傳代：細胞在培養(yǎng)器皿中生長一定時間后，被分開接種到新的培養(yǎng)器皿中。原代培養(yǎng)取自體內(nèi)新鮮組織并置于體外條件下生長的細胞在傳代之前稱為原代培養(yǎng)。接觸抑制（Contactinhibition）細胞相互接觸時，將停止增長；細胞停留在細胞周期的G0期；轉(zhuǎn)化的細胞卻可以繼續(xù)生長導致細胞重疊堆積生長。體外培養(yǎng)的細胞增殖能力不是無限的，傳代次數(shù)有一定的界限，稱為“Hayflick極限”。傳代次數(shù)與物種壽命有關(guān)：小鼠壽命3年，傳代12次；龜壽命200年，傳代140次。傳代次數(shù)與個體年齡成反比：人胚胎，40-60代；

3、幼年，20-40代；成年，10-30代；早老病兒童，2-10代。細胞傳代次數(shù)（PassageNumber）原代培養(yǎng)（primary?culture）從動物機體取出的進行培養(yǎng)的細胞群。生長緩慢，繁殖一定的代數(shù)后（一般10代以內(nèi)）停止生長?？寺。╟lone）亦稱無性繁殖系或無性系。對細胞來說，克隆是指由同一個祖先細胞通過有絲分裂產(chǎn)生的遺傳性狀一致的細胞群。細胞系（cell?line）從腫瘤組織培養(yǎng)建立的細胞群或培養(yǎng)過程中發(fā)生突變或轉(zhuǎn)化的細胞，在培養(yǎng)條件下可無限繁殖細胞株（cell?strain）從原代培養(yǎng)細胞群中篩選出的具有特定性質(zhì)或標志的細胞群，

4、能夠繁殖50代左右，在培養(yǎng)過程中其特征始終保持。原代培養(yǎng)與細胞系原代培養(yǎng)細胞的生命歸宿原代培養(yǎng)期傳代期衰退期TheAmericanTypeCultureCollection(ATCC)TheEuropeanCollectionofAnimalCellCulture(ECACC)NationalInstituteofHealth(NIH),USANationalCancerInstitute(NCI),USA細胞系資源有限細胞系，無限細胞系細胞系cellline細胞株cellstrain培養(yǎng)細胞的特性培養(yǎng)細胞的生長方式貼附生長：必須貼附于支持物表

5、面才能生長。見于各種實體瘤細胞懸浮生長：于懸浮狀態(tài)下即可生長，不需要貼附于支持物表面。見于各種造血系統(tǒng)腫瘤細胞每代貼附生長細胞的生長過程游離期貼壁期潛伏期對數(shù)生長期停止期（平臺期）游離期：細胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)．也稱懸浮期。此時細胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。10分鐘一4小時貼壁期：細胞附著于底物上，游離期結(jié)束。細胞株平均在10分鐘一4小時貼壁。底物：膠原、玻璃、塑料、其它細胞等血清中有促使細胞貼壁的冷析球蛋白和纖粘素、膠原等糖蛋白（生長基質(zhì)），這些帶正電荷的糖蛋白的促貼壁因子先吸附于底物上，懸浮細胞再與吸附有促貼壁因子的附著。進口塑料培養(yǎng)瓶

6、涂有生長基質(zhì)（化學合成的功能基團）潛伏期此時細胞有生長話動，而無細胞分裂。細胞株潛伏期一般為6～24小時。對數(shù)生長期：細胞數(shù)隨時間變化成倍增長，活力最佳，最適合進行實驗研究。停止期（平臺期）：細胞長滿瓶壁后，細胞雖有活力但不再分裂機制：接觸抑制、密度依賴性二、細胞培養(yǎng)基本要求常用儀器設(shè)備培養(yǎng)器皿培養(yǎng)基血清其他細胞培養(yǎng)試劑培養(yǎng)細胞生長的條件1細胞的營養(yǎng)需要2細胞的生存環(huán)境溫度:37℃O2CO2:5%CO2+H2O←→H2CO3←→H++HCO3-pH:7.2-7.4滲透壓3無污染4無毒常用儀器設(shè)備超凈工作臺，壓力蒸汽消毒器，電熱干燥箱，濾器，酸缸

7、CO2培養(yǎng)箱倒置顯微鏡酶標儀、微孔板震蕩器液氮罐自動雙重純水蒸餾器，純水儀耗材：培養(yǎng)瓶，吸管，電動吸引器，培養(yǎng)板，凍存管壓力蒸汽消毒器：濕熱消毒，用途廣電熱干燥箱：干熱消毒（160℃，2小時）。主要用干玻璃器皿消毒濾器：過濾除菌：大多數(shù)培養(yǎng)用液，如人工合成培養(yǎng)基、血清、酶液等均采用濾過法除菌超凈工作臺：為細胞操作提供無菌環(huán)境紫外燈：紫外線消毒。主要用于培養(yǎng)室空氣、操作臺、塑料培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板等表面消毒超凈臺超凈工作臺的工作原理是利用鼓風機驅(qū)動空氣遁過高效濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐通過工作臺面，使工作臺內(nèi)構(gòu)成無菌環(huán)境。濾

8、器CO2培養(yǎng)箱CO2培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為37℃，5％CO2。使用CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)細胞時應注意的問題：①用螺旋口瓶培養(yǎng)細胞時，需將瓶蓋微松，以保證通氣。②