光電比濁計數(shù)法

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1、光電比濁計數(shù)法一、目的要求1．了解光電比濁計數(shù)法的原理。2．學習、掌握光電比濁計數(shù)法的操作方法。二、基本原理當光線通過微生物菌懸液時，由于菌體的散射及吸收作用使光線的透過量降低。在一定的范圍內(nèi)，微生物細胞濃度與透光度成反比，與光密度成正比，而光密度或透光度可以由光電池精確測出(圖15-4)。因此，可用一系列已知菌數(shù)的菌懸液測定光密度，作出光密度—菌數(shù)標準曲線。然后，以樣品液所測得的光密度，從標準曲線中查出對應的菌數(shù)。制作標準曲線時，菌體計數(shù)可采用血細胞計數(shù)板計數(shù)，平板菌落計數(shù)或細胞干重測定等方法。本實驗采用血細胞計數(shù)板計數(shù)。光電比濁計數(shù)法的優(yōu)點是簡便、

2、迅速，可以連續(xù)測定，適合于自動控制。但是，由于光密度或透光度除了受菌體濃度影響之外，還受細胞大小、形態(tài)、培養(yǎng)液成分以及所采用的光波長等因素的影響。因此，對于不同微生物的菌懸液進行光電比濁計數(shù)應采用相同的菌株和培養(yǎng)條件制作標準曲線。光波的選擇通常在400~700nm之間，具體到某種微生物采用多少還需要經(jīng)過最大吸收波長以及穩(wěn)定性試驗來確定。另外，對于顏色太深的樣品或在樣品中還含有其他干擾物質(zhì)的懸液不適合用此法進行測定。（三）器材1．菌種釀酒酵母培養(yǎng)液2．儀器或其他用具721型分光光度計，血細胞計數(shù)板，顯微鏡，試管，吸水紙，無菌吸管，無菌生理鹽水等。（四）操

3、作步驟1．標準曲線制作（1）編號取無菌試管7支，分別用記號筆將試管編號為1、2、3、4、5、6、7。（2）調(diào)整菌液濃度用血細胞計數(shù)板計數(shù)培養(yǎng)24小時的釀酒酵母菌懸液，并用無菌生理鹽水分別稀釋調(diào)整為每毫升1×106、2×106、4×106、6×106、8×106、10×106、12×106含菌數(shù)的細胞懸液。再分別裝入已編好號的1至7號無菌試管中。（3）測OD值將1至7號不同濃度的菌懸液搖均勻后于560nm波長、1cm比色皿中測定OD值。比色測定時，用無菌生理鹽水作空白對照，并將OD值填入下表每管菌懸液在測定OD值時均必須先搖勻后再倒入比色皿中測定(4)以

4、光密度(OD)值為縱坐標，以每毫升細胞數(shù)為橫坐標，繪制標準曲線。2．樣品測定將待測樣品用無菌生理鹽水適當稀釋，搖均勻后，用560nm波長、lcm比色皿測定光密度。測定時用無菌生理鹽水作空白對照。各種操作條件必須與制作標準曲線時的相同，否則，測得值所換算的含菌數(shù)就不準確。3．根據(jù)所測得的光密度值，從標準曲線查得每毫升的含菌數(shù)。（五）實驗報告l．結(jié)果每毫升樣品原液菌數(shù)=從標準曲線查得每毫升的菌數(shù)×稀釋倍數(shù)