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《探索雞白痢沙門氏菌分離株耐藥性》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫(kù)。
1、探索雞白痢沙門氏菌分離株的耐藥性1材料1.1菌株2007年從江蘇省東臺(tái)及周邊地區(qū)疑似雞白痢的病死雞中分離鑒定的33株雞白痢沙門氏菌，由揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病學(xué)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室分離和保存。代寫碩士論文英語(yǔ)碩士論文1.2培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基（tryptone10g，yeastextract5g，NaCl10g，加蒸餾水至1000mL，pH7.2）購(gòu)自O(shè)xoid公司。瓊脂粉為中國(guó)醫(yī)藥（集團(tuán)）上海化學(xué)試劑公司產(chǎn)品。1.3主要試劑ExTaq、DNAFragmentPurificationKit、AgaroseGelDNAPuri
2、ficationKit、MiniBESTBacterialGenomicDNAExtractionKit、DNAmarker購(gòu)自大連TaKaRa公司；PCR試劑盒、dNTP購(gòu)自Promega公司；Ampicillin、IPTG、X-gal購(gòu)自Roche公司（德國(guó)）；Tryptone、Yeastextract為Oxoid產(chǎn)品；NaAc、SDS、EDTA購(gòu)自Sigma公司；質(zhì)粒提取試劑盒為Qiagen公司產(chǎn)品；克隆載體為pGEM-TeasyVector，購(gòu)自Promega公司；15種藥敏紙片購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司。
3、其它常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)產(chǎn)品。DNA測(cè)序工作由上海聯(lián)合基因科技有限公司完成。2方法2.1藥敏試驗(yàn)及多重耐藥析瓊脂紙片擴(kuò)散法(Kirby-Bauer，K-B），從孵育了16-24h的LB瓊脂平板上，挑出單個(gè)菌落，直接用生理鹽水制成0.5麥?zhǔn)蠁挝?。?5分鐘內(nèi)，用無(wú)菌棉拭子蘸取調(diào)好的菌液，在LB培養(yǎng)基表面涂布接種，將確定好的藥敏紙片分貼到平板表面。紙片一旦與平板接觸，不應(yīng)再移動(dòng)。37℃孵育18~20h以后，測(cè)量各藥敏紙片抑菌圈直徑，按藥敏紙片制造商給出的抑菌標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果判定。2.2磺胺類耐藥菌株耐藥基因的擴(kuò)增與序列
4、測(cè)定根據(jù)沙門氏菌耐藥的表型，選取針對(duì)兩種磺胺類藥物均產(chǎn)生耐藥性的菌株作為試驗(yàn)菌株。2.2.1模板的制備細(xì)菌DNA模板的制備按全菌裂解法進(jìn)行，取適量20h細(xì)菌培養(yǎng)物離心，沉淀用滅菌超純水懸浮，使細(xì)菌濃度約為3×109CFU/mL；100℃水浴10min，置于冰浴中冷卻；4℃10000rpm離心10min，取上清1μL作為PCR模板。2.2.2PCR引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)發(fā)表的序列，設(shè)計(jì)了3對(duì)引物，分別擴(kuò)增磺胺類耐藥基因sul1、sul2和I類整合子。引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。2.2.3PCR反應(yīng)用來(lái)擴(kuò)增耐藥
5、基因和整合子的PCR擴(kuò)增體系為：在總量為25μL的反應(yīng)體系中加1.0μM上游和下游引物（引物濃度為20μM），1×Taq聚合酶緩沖液，1.5mMMgCl2，200μMdNTP（dATP，dCTP，dGTP和dTTP），0.025U/μLTaq聚合酶（或ExTaq用于擴(kuò)增Ⅰ類整合子），大約1μg模板DNA，加滅菌超純水至25μL。PCR反應(yīng)參數(shù)如下：sul1-F/R為94°C5min，然后94℃30s，52℃30s，72℃60s，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸7min；sul2-F/R為94°C5min，然后94℃，30s，
6、55℃30s，72℃50s，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸7min；Ⅰ類整合子5’CS/3’CS采用遞減PCR（TouchDownPCR），94℃5min預(yù)變性，94℃45s，61℃（每個(gè)循環(huán)降低1℃）45s，72℃90s，5個(gè)循環(huán)；94℃45s，56℃45s，72℃90s，共30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。循環(huán)結(jié)束后，取PCR反應(yīng)產(chǎn)物通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。2.2.4耐藥基因的克隆將50μLPCR產(chǎn)物用TakaraDNAFragmentPurificationKit純化回收，最后溶解到25μL滅菌超純水中。按以
7、下體系建立T-A連接：取2×Rapidligationbuffer5μL，依次加入pGEM-TeasyVector1μL，PCR產(chǎn)物3μL，T4DNAligase1μL，混勻后室溫連接6h或4℃過(guò)夜。取5μL連接產(chǎn)物（DNA<50ng）轉(zhuǎn)化200μL感受態(tài)細(xì)菌，挑選單個(gè)白色菌落，堿裂解法小提質(zhì)粒，根據(jù)酶切鑒定結(jié)果，將陽(yáng)性克隆送上海聯(lián)合基因科技有限公司進(jìn)行DNA序列測(cè)定。通過(guò)NationalCenterforBiotechnologyInformation（NCBI）中的BLASTn搜索進(jìn)行DNA的同源比較。3結(jié)果3
8、.1雞白痢沙門氏菌的耐藥性33株雞白痢沙門氏菌的藥敏試驗(yàn)顯示丁胺卡那、卡那霉素、慶大霉素、環(huán)丙沙星、氟苯尼考的抑菌作用較強(qiáng)，所有受試菌株均對(duì)其敏感；氯霉素、新霉素、恩諾沙星和羧芐青霉素次之，高敏菌株的比例分別為94%、91%、61%和58%；而四環(huán)素、復(fù)方磺胺、磺胺異惡唑的抑菌作用較差，耐藥菌株的比例分別為88%、64%和61%；對(duì)于頭孢噻肟和氨芐青霉素來(lái)說(shuō)
