犬孕激素酶聯(lián)免疫分析(progestogen)

犬孕激素酶聯(lián)免疫分析(progestogen)

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1、犬孕激素酶聯(lián)免疫分析(progestogen)ELISA試劑盒使用說明書本試劑盒僅供研究研究使用產(chǎn)品編號(hào):E0697c預(yù)期應(yīng)用ELISA法定量測定犬血清、血漿、或其它相關(guān)液體中孕激素含量。概述孕激素主要由黃體產(chǎn)生,故又叫黃體酮。孕激素通常要在孕激素作用的基礎(chǔ)上才能發(fā)揮其作用。孕激素的主要作用,是促進(jìn)子宮內(nèi)膜特別是腺體的增長,為接納受精卵做好準(zhǔn)備,如受精卵著床后,使胚胎繼續(xù)發(fā)育。對(duì)子宮內(nèi)膜癌及增生過度的內(nèi)膜腺體,孕激素則能使之萎縮退化。此外還能抑制子宮收縮,并減弱子宮對(duì)催產(chǎn)素的敏感性,使子宮活動(dòng)減少,而起保胎作用。同時(shí)還與孕激素一起使乳腺發(fā)育,為產(chǎn)乳作好準(zhǔn)備。實(shí)驗(yàn)

2、原理本試劑盒應(yīng)用競爭抑制酶標(biāo)免疫分析法測定標(biāo)本中孕激素水平。用純化的抗體包被微孔板,制成固相抗體,固相抗體與一定量的生物素標(biāo)記的孕激素和非標(biāo)記抗原(標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品)進(jìn)行競爭抑制反應(yīng),待測定的標(biāo)本量越多,抗體與生物素標(biāo)記的孕激素結(jié)合就越少,反之結(jié)合就多。最后再加入HRP標(biāo)記的親和素,經(jīng)過徹底洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的孕激素呈負(fù)相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度(OD值),計(jì)算樣品濃度。試劑盒組成1.酶聯(lián)板:一塊(96孔)2.標(biāo)準(zhǔn)品:0.5ml/瓶×6瓶。其濃度依次為100

3、ng/mL,20ng/mL,5ng/mL,1ng/mL和0.2ng/mL,0ng/mL。3.檢測溶液A:1×6ml4.檢測溶液B:1×6ml5.底物溶液A:1×7ml6.底物溶液B:1×7ml7.濃洗滌液:1×15ml,使用時(shí)每瓶用蒸餾水稀釋20倍。8.終止液:1×7ml標(biāo)本的采集及保存1.血清:采集病人空腹血,標(biāo)本請(qǐng)于室溫放置2小時(shí)或4℃過夜后于1000xg離心20分鐘,取上清即可檢測,或?qū)?biāo)本放于-20℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。2.血漿:采集病人空腹血,可用EDTA或肝素作為抗凝劑,標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2-8°C1000xg離心15分鐘,或?qū)?biāo)本放于-20

4、℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。注:標(biāo)本溶血會(huì)影響最后檢測結(jié)果,因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測。操作步驟各試劑在使用前平衡至室溫。1.加樣:分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔。除空白孔外,余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)溶液或待測樣品50ul。1.每孔加入檢測溶液A50ul及檢測溶液B50ul,輕輕混勻,37℃,60分鐘。2.洗板3-5次,350ul/每孔,甩干。4.依序每孔加底物溶液A、B各50ul,37℃避光顯色15分鐘。5.依序每孔加終止溶液50ul,終止反應(yīng)。用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度(OD值)。注:1.每次實(shí)驗(yàn)留一孔作為空白調(diào)零孔,該孔不加任何試劑,只是最后加底

5、物溶液及2NH2SO4。測量時(shí)先用此孔調(diào)OD值至零。2.為防止樣品蒸發(fā),試驗(yàn)時(shí)將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)。洗板方法手工洗板方法:吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體;在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上鋪墊幾層吸水紙,酶標(biāo)板朝下用力拍幾次;將推薦的洗滌緩沖液至少0.4ml注入孔內(nèi),浸泡1-2分鐘,根據(jù)需要,重復(fù)此過程數(shù)次。自動(dòng)洗板:如果有自動(dòng)洗板機(jī),應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過程中。特異性本試劑盒可同時(shí)檢測重組或天然的犬T3,且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。檢測范圍:0.015ng/mL-120ng/mL計(jì)算以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)(對(duì)數(shù)坐標(biāo)),OD值為縱坐標(biāo)(普通坐標(biāo)),在半對(duì)數(shù)坐

6、標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度;再乘以稀釋倍數(shù);或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式,將樣品的OD值代入方程式,計(jì)算出樣品濃度,再乘以稀釋倍數(shù),即為樣品的實(shí)際濃度。注意事項(xiàng)1.洗滌過程非常重要,不充分的洗滌易造成假陽性。2.一次加樣時(shí)間最好控制在5分鐘內(nèi),如標(biāo)本數(shù)量多,推薦使用排槍加樣。3.請(qǐng)每次測定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線,最好做復(fù)孔。4.如標(biāo)本中T3含量過高,請(qǐng)先稀釋后再測定,計(jì)算時(shí)請(qǐng)最后乘以稀釋倍數(shù)。5.底物請(qǐng)避光保存。6.溫育反應(yīng)過程中請(qǐng)?zhí)衬z板7.樣品應(yīng)盡早檢測,貯存時(shí)間長,內(nèi)含被檢測物的活性將損失。說明1.試劑

7、盒保存:-20℃(較長時(shí)間不用時(shí));2-8℃(頻繁使用時(shí))。2.有效期:6個(gè)月3.濃洗滌液會(huì)有鹽析出,稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶。4.中、英文說明書可能會(huì)有不一致之處,請(qǐng)以英文說明書為準(zhǔn)。

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