豬瘟檢測方法

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1、豬瘟檢測方法豬瘟間接血凝試驗操作方法（一）試驗材料1．96孔110~120°V型醫(yī)用血凝板2．10~100微升可調(diào)微量移液器3．塑料咀4．豬瘟間接血凝抗原（豬瘟正向血凝診斷液），每瓶5毫升，可檢測血清25~30頭份5．陽性對照血清，每瓶2毫升；陰性對照血清，每瓶2毫升6．稀釋液每瓶10毫升7．待檢血清每份0.2~0.5毫升（56℃水浴滅活30分鐘）（二）操作步驟1．檢測前，應(yīng)將凍干診斷液，每瓶加稀釋液5毫升浸泡7~10天后方可應(yīng)用。2．稀釋待檢血清：在血凝板上的第1孔~第6孔各加稀釋液50微升。吸取待檢血清50微升加入第1孔，混勻后從中取出50微升加入第2

2、孔，依此類推直至第6孔混勻后丟棄50微升，從第1孔——第6孔的血清稀釋度依次為1：2、1：4、1：8、1：16、1：32、1：64。3．稀釋陰性和陽性對照血清：在血凝板上的第11排第1孔加稀釋液60微升，取陰性血清20微升混勻取出30微升丟棄。此孔即為陰性血清對照孔。在血凝板上的第12排第1孔加稀釋液70微升，第2——7孔各加稀釋液50微升，取陽性血清10微升加入第1孔混勻，并從中取出50微升加入第2孔混勻后取出50微升加入第3孔……直到第7孔混勻后棄50微升，該孔的陽性血清稀釋度為1：512。4．在血凝板上的第1排第8孔加稀釋液50微升，作為稀釋液對照孔

3、。5．判定方法和標(biāo)準(zhǔn)：先觀察陰性血清對照孔和稀釋液對照孔，紅血球應(yīng)全部沉入孔底，無凝集現(xiàn)象（—）或呈（+）的輕度凝集為合格；陽性血清對照應(yīng)呈（+++）凝集為合格。在以上3孔對照合格的前提下，觀察待檢血清各孔的凝集程度，以呈“++”凝集的待檢血清最大稀釋度為其血凝效價（血凝價）。血清的血凝價達(dá)到1：16為免疫合格?！?”表示紅細(xì)胞100%沉于孔底，完全不凝集“+”表示約有25%的紅細(xì)胞發(fā)生凝集“++”表示50%紅細(xì)胞出現(xiàn)凝集“+++”表示75%紅細(xì)胞凝集“++++“表示90—100%紅細(xì)胞凝集6．注意事項（1）勿用90°或130°血凝板，以免誤判。（2）污染

4、嚴(yán)重或溶血嚴(yán)重的血清樣品不宜檢測。（3）凍干血凝抗原，必須加稀釋液浸泡7~10天，方可使用，否則易發(fā)生自凝現(xiàn)象。（1）用過的血凝板，應(yīng)及時沖冼干凈，勿用毛刷或其他硬物刷洗板孔，以免影響孔內(nèi)光潔度。（2）使用血凝抗原時，必須充分搖勻，瓶底應(yīng)無血球沉積。（3）液體血凝抗原4~8℃貯存有效期四個月，可直接使用。凍干血凝抗原4~8℃貯存有效期三年。（4）如來不及判定結(jié)果或靜置2小時結(jié)果不清晰，也可放置第2天判定。（5）每次檢測，只設(shè)陰性、陽性血清和稀釋液對照各1孔。（6）稀釋不同的試劑要素時，必須更換塑料咀。（10）血凝板和塑料咀洗凈后，自然干燥，可重復(fù)使用。(李

5、樹春)豬瘟病毒強弱毒鑒別診斷ELISA操作方法（一）試驗材料1．豬瘟弱毒單抗純化酶聯(lián)抗原和豬瘟強毒單抗純化酶聯(lián)抗原，分別供檢測經(jīng)豬瘟弱毒疫苗免疫后產(chǎn)生的抗體和感染豬瘟強毒后產(chǎn)生的抗體之用。2．酶標(biāo)抗體3．豬瘟陽性、陰性血清4．酶聯(lián)板及其他必要的試劑。（二）操作步驟1．用包被液將豬瘟弱毒單抗純化酶聯(lián)抗原、豬瘟強毒單抗純化酶聯(lián)抗原各作100倍稀釋，以100微升分別加入做好標(biāo)記的酶聯(lián)板孔中，置濕盒于4℃過夜。2．棄去孔內(nèi)液體。用洗滌液沖洗酶聯(lián)板3次，每次間隔3~5分鐘，拍干。3．用稀釋液將待檢血清作400倍稀釋，每孔加100微升。同時，將豬瘟陽性、陰性血清以10

6、0稀釋作對照，37℃培育1.5~2小時。4．重復(fù)第2步。5．用稀釋液將兔抗豬IgG—辣根過氧化物酶結(jié)合物作100倍稀釋，每孔加入100微升，37℃培育1.5~2小時。6．重復(fù)第2步。7．每孔加入底物溶液（每塊板所需的底物溶液按鄰苯二胺5毫克+底物緩沖液5毫升+30%過氧化氫18.75微升配制）100微升，室溫下觀察顯色反應(yīng)（一般陰性對照孔略微顯色，立即終止反應(yīng)，并以陰性孔作空白調(diào)零）。8．每孔加入終止液50微升，于酶聯(lián)讀數(shù)儀上測定490nm波長的光密度（OD）。（三）判定標(biāo)準(zhǔn)在豬瘟弱毒酶聯(lián)板上：OD>0.2為豬瘟弱毒抗體陽性O(shè)D<0.2為豬瘟弱毒抗體陰性在

7、豬瘟強毒酶聯(lián)板上：OD≥0.5為豬瘟強毒抗體陽性O(shè)D<0.5為豬瘟強毒抗體陰性（四）注意事項1．運輸單抗純化酶聯(lián)抗原時，必須使用冰盒低溫運輸；豬瘟強弱毒單抗純化酶聯(lián)抗原在4℃保存6個月，在—18℃保存12個月。2．配制洗滌液時，應(yīng)使用新鮮蒸餾水或無離子水，每次洗板后，盡量不使孔中有殘余液體，以免影響結(jié)果。3．底物溶液應(yīng)臨用前配制，待鄰苯二胺完全溶解于底物緩沖液后再加過氧化氫，混勻后立即加入孔中。1．終止反應(yīng)后，應(yīng)立即讀數(shù)。(中國獸藥監(jiān)察所)豬瘟反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)1．材料準(zhǔn)備：待檢組織，勻漿器、氯仿、異丙醇、75%乙醇、生理鹽水，RNA提取試劑盒（Omega

8、），RT-PCR試劑盒（TakaRa）等。引物：擴(kuò)增豬瘟病毒E2基