金菩嘉FISH技術(shù)

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1、第三節(jié)FISH技術(shù)熒光原位雜交(fluorescenceinsituhybridization,F(xiàn)ISH)技術(shù)是生物學(xué)領(lǐng)域的一項技術(shù),廣泛的應(yīng)用于臨床診斷、細(xì)胞遺傳學(xué)研究、競爭性整組DNA雜交試驗,以及基因圖譜繪制中。因本書主要介紹病理技術(shù),所以首先要講述一下FISH在病理診斷中的應(yīng)用。特別是在實體瘤方面,HER-2/neu基因探針已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用。1998年美國政府FDA批準(zhǔn)了作為基因治療的一種單克隆抗體Herceptin,可配合化療來治療部分按期轉(zhuǎn)移性乳腺癌病人,約25%-30%的乳腺癌病人有HER-2/neu腫瘤基因的放大或過度表達(dá),這部分人適合Herceptin治療

2、。在下文的實驗操作中,我們將重點介紹HER-2基因的FISH操作。一、FISH原理FISH技術(shù)的原理是利用已知的標(biāo)記單鏈核酸為探針,按照堿基互補(bǔ)的原則,與待檢材料中未知的單鏈核酸進(jìn)行異性結(jié)合,形成可被檢測的雜交雙鏈核酸。由于DNA分子在染色體上是沿著染色體縱軸呈線性排列,因而可以探針直接與染色體進(jìn)行雜交從而將特定的基因在染色體上定位。二、乳腺石蠟切片F(xiàn)ISH操作步驟方法1、實驗試劑(1)20×SSC(pH5.3):氯化鈉88g,檸檬酸鈉44g,去離子水400mL充分溶解。室溫下12mol/LHCl調(diào)節(jié)PH值至5.3,用去離子水定容至500mL,高壓滅菌,使用期間2-8℃儲存,保

3、存期不要超過6個月。(2)2×SSC(pH7.0±0.2):20×SSC(PH5.3)100mL,去離子水800mL,充分混勻,室溫下10MNaOH調(diào)節(jié)pH值至7.0±0.2,用去離子水定容至1L。使用期間2-8℃儲存,保存期不要超過6個月。(3)變性液:甲酰胺35mL,20×SSC(PH5.3)5mL充分混勻,室溫下調(diào)節(jié)PH值至7.0-8.0,用去離子水定容至50mL,使用期間2-8℃儲存。(4)甲酰胺洗滌液:甲酰胺75mL,20×SSC(PH5.3)15mL充分混勻,室溫下調(diào)節(jié)PH值至7.0-8.0,用去離子水定容至150mL,使用期間2-8℃儲存。(5)30%(W/V)酸

4、性亞硫酸鈉:15g酸性亞硫酸鈉溶于40mL去離子水中,輕輕搖動至完全溶解,加去離子水定容至50mL。(6)蛋白酶K儲存液(20mg/mL):0.1g蛋白酶K干粉溶于5mL2×SSC(pH7.0)溶液中,輕輕搖動,直至蛋白酶K完全溶解,-20℃分裝儲存。蛋白酶K工作液(200ug/mL):取0.4mL蛋白酶K儲存液(20mg/mL)溶于40mL2×SSC(pH7.0)溶液中。(7)0.1%NP-40/2×SSC洗液:20×SSC(pH5.3)40mL,NP-400.4mL,去離子水300mL充分混勻,室溫下10MNaOH調(diào)節(jié)pH值至7.0±0.2,去離子水定容至400mL。使用期

5、間2-8℃儲存,保存期不要超過6個月。2、操作步驟預(yù)處理程序:(1)樣本的制備:10%中性福爾馬林固定,石蠟包埋組織,切片厚度為4μm。(2)將組織粘附于經(jīng)硅化處理的載玻片上,80℃烤片機(jī)烤片30分鐘以上,放入65℃烤箱烤片過夜,使組織切片更緊的粘附在玻片上防止脫片。(3)脫蠟:二甲苯10分鐘×2;5分鐘×1,隨后浸入100%乙醇中5分鐘。(4)將切片依次置于100%乙醇、85%乙醇和70%乙醇中各兩分鐘,隨后浸入去離子水中3分鐘,吸取多余水分。(5)50℃,30%(W/V)酸性亞硫酸鈉處理20-30分鐘。(6)于2×SSC溶液中漂洗2次,每次5分鐘。(7)將組織切片浸泡在蛋白

6、酶K工作液中,37℃下孵育10-30分鐘。(8)于2×SSC溶液中漂洗2次,每次5分鐘。(9)將切片置于0.1MHCl中室溫浸泡5-10分鐘,于2×SSC溶液中漂洗2次,每次5分鐘,將切片置于-20℃預(yù)冷的70%、85%、100%乙醇中各2分鐘脫水。(10)將切片室溫浸入丙酮溶液中2分鐘,自然干片。(11)56℃,烤片2-5分鐘。標(biāo)本準(zhǔn)備及變性(12)將盛有變性液的容器置于73±1℃水浴箱中約30分鐘,使溶液達(dá)到所需溫度,將玻片在變性液中浸泡5分鐘。(13)將玻片依次置于預(yù)冷的70%、85%、100%乙醇中各3分鐘進(jìn)行梯度脫水。玻片自然干燥后,置于45-50℃烤片機(jī)上預(yù)熱2-5

7、分鐘后與探針雜交。探針混合物準(zhǔn)備及變性(14)將7μl雜交緩沖液、1μl去離子水、2μl探針加入到微量離心管中,離心1-3秒,渦旋混勻后再次短暫離心。(15)裝有探針混合物的試管置于73±1℃水浴箱中變性5分鐘之后,將該試管置于45-50℃水浴箱中,雜交前取出。探針與樣本雜交(16)將10uL變性后的探針混合物滴于玻片雜交區(qū)域,立即加蓋蓋玻片,用橡皮膠封邊。(17)將玻片置于預(yù)熱的濕盒中,42℃保溫箱中過夜雜交。玻片洗滌(18)46±1℃,50%甲酰胺/2×SSC溶液10分鐘×3(pH7.0

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