生物催化與生物轉(zhuǎn)化IV

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1、Chapter11ModificationofEnzymeMolecule酶的分子修飾Contentsofchapter111、什么是酶分子修飾2、酶分子修飾的基本要求和條件3、酶分子的修飾方法4、酶修飾后的性質(zhì)變化GoGoGoGo5、酶的定向進(jìn)化Go11.1什么是酶分子修飾？通過各種方法使酶分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改變酶的某些特性和功能的技術(shù)過程稱為酶分子修飾。即：在體外將酶分子通過人工的方法與一些化學(xué)基團(tuán)（物質(zhì)），特別是具有生物相容性的物質(zhì)，進(jìn)行共價(jià)連接，從而改變酶的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。酶分子修

2、飾的意義提高酶的活力activity增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性stability降低或消除酶的抗原性immunologicalproperty研究和了解酶分子中主鏈、側(cè)鏈、組成單位、金屬離子和各種物理因素對酶分子空間構(gòu)象的影響structure回本章目錄11.2酶分子修飾的基本要求和條件對酶分子進(jìn)行修飾必須在修飾原理、修飾劑和反應(yīng)條件的選擇以及酶學(xué)性質(zhì)等方面都要有足夠的了解。（1）酶的穩(wěn)定性熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性、作用溫度、pH、抑制劑等。（2）酶活性中心的狀況活性中心基團(tuán)、輔因子等。其他如分子大小、性狀、亞

3、基數(shù)等。酶分子修飾的條件修飾反應(yīng)盡可能在酶穩(wěn)定條件下進(jìn)行，并盡量不破壞酶活性功能的必需基團(tuán)，使修飾率高，同時(shí)酶的活力回收高。（1）pH與離子強(qiáng)度pH決定了酶蛋白分子中反應(yīng)基團(tuán)的解離狀態(tài)。由于它們的解離狀態(tài)不同，反應(yīng)性能也不同。（2）修飾反應(yīng)的溫度與時(shí)間嚴(yán)格控制溫度和時(shí)間可以減少以至消除一些非專一性的修飾反應(yīng)。（3）反應(yīng)體系中酶與修飾劑的比例回本章目錄11.3酶分子的修飾方法金屬離子置換修飾,大分子結(jié)合修飾(共價(jià)/非共價(jià))側(cè)鏈基團(tuán)修飾肽鏈有限水解修飾氨基酸置換修飾酶分子的物理修飾(1)酶的金屬離子

4、置換修飾把酶分子中的金屬離子換成另一種金屬離子，使酶的特性和功能發(fā)生改變的修飾方法稱為金屬離子置換修飾。α-淀粉酶中的鈣離子（Ca2+），谷氨酸脫氫酶中的鋅離子(Zn2+)，過氧化氫酶分子中的鐵離子(Fe2+)，酰基氨基酸酶分子中的鋅離子（Zn2+）,超氧化物歧化酶分子中的銅、鋅離子(Cu2+,Zn2+)若從酶分子中除去其所含的金屬離子，酶往往會喪失其催化活性。如果重新加入原有的金屬離子，酶的催化活性可以恢復(fù)或者部分恢復(fù)。若用另一種金屬離子進(jìn)行置換，則可使酶呈現(xiàn)出不同的特性。有的可以使酶的活性降

5、低甚至喪失，有的卻可以使酶的活力提高或者增加酶的穩(wěn)定性。金屬離子置換修飾的過程a.酶的分離純化：首先將欲進(jìn)行修飾的酶經(jīng)過分離純化，除去雜質(zhì)，獲得具有一定純度的酶液。b.除去原有的金屬離子：在經(jīng)過純化的酶液中加入一定量的金屬螯合劑，如乙二胺四乙酸（EDTA）等，使酶分子中的金屬離子與EDTA等形成螯合物。通過透析、超濾、分子篩層析等方法，將EDTA-金屬螯合物從酶液中除去。此時(shí)，酶往往成為無活性狀態(tài)。c.加入置換離子：于去離子的酶液中加入一定量的另一種金屬離子，酶蛋白與新加入的金屬離子結(jié)合，除去多

6、余的置換離子，就可以得到經(jīng)過金屬離子置換后的酶。金屬離子置換修飾只適用于那些在分子結(jié)構(gòu)中本來含有金屬離子的酶。用于金屬離子置換修飾的金屬離子，一般都是二價(jià)金屬離子。(2)酶的大分子修飾使用一些能與酶非共價(jià)地相互作用而又能有效地保護(hù)酶的一些添加物，如聚乙二醇、右旋糖苷等，它們既能通過氫鍵固定在酶分子表面，也能通過氫鍵有效地與外部水相連，從而保護(hù)酶的活力。一些添加物，如多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等能通過調(diào)節(jié)酶的微環(huán)境來保護(hù)酶的活力。另一類添加物就是蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)分子之間相互作用時(shí)，其表面區(qū)域內(nèi)排

7、除了水分子，因而增加了相互作用力，其穩(wěn)定性也就增加了。非共價(jià)修飾用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通過共價(jià)鍵連接于酶分子的表面，形成一層覆蓋層。例如：用聚乙二醇修飾超氧物歧化酶，不僅可以降低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延長了酶在體內(nèi)的半衰期從而提高了酶藥效。每分子核糖核酸酶與6.5分子的右旋糖酐結(jié)合，可以使酶活力提高到原有酶活力的2.25倍；每分子胰凝乳蛋白酶與11分子右旋糖酐結(jié)合，酶活力達(dá)到原有酶活力的5.1倍共價(jià)修飾大分子修飾(共價(jià))的過程修飾劑的選擇：大分子結(jié)合

8、修飾采用的修飾劑是水溶性大分子。例如，聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐、蔗糖聚合物（Ficoll）、葡聚糖、環(huán)狀糊精、肝素、羧甲基纖維素、聚氨基酸等。要根據(jù)酶分子的結(jié)構(gòu)和修飾劑的特性選擇適宜的水溶性大分子。修飾劑的活化：作為修飾劑中含有的基團(tuán)往往不能直接與酶分子的基團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)而結(jié)合在一起。在使用之前一般需要經(jīng)過活化，然后才可以與酶分子的某側(cè)鏈基團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)。修飾：將帶有活化基團(tuán)的大分子修飾劑與經(jīng)過分離純化的酶液，以一定的比例混合，在一定的溫度、pH值等條件下反應(yīng)一段時(shí)間，使修飾劑的活化基團(tuán)與酶分子的某