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《Odyssey紅外激光成像系統(tǒng)-蛋白研究的多功能平臺(tái)》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、Odyssey紅外激光成像系統(tǒng)—蛋白研究的多功能平臺(tái)WesternBlot常見檢測(cè)方法化學(xué)顯色法:靈敏度低，無法定量。放射自顯影法：對(duì)身體有害，操作復(fù)雜。化學(xué)發(fā)光法:無法精確定量，操作復(fù)雜?？乖豢菇Y(jié)合紅外熒光標(biāo)記的二抗Infrareddye(IRD800,Alexa680)ODYSSEY成像原理INFRAREDLASERDIODEINFRAREDAPDDETECTOR準(zhǔn)確定量Widelineardynamicrange操作簡便,直接檢測(cè)Nofilm,darkroom,ormessysubstrates靈敏度高Equaltoorbetterthan
2、chemiluminescence多色檢測(cè)NormalizationincreasesquantificationaccuracyOdyssey系統(tǒng)的特點(diǎn)紅外熒光－準(zhǔn)確定量TIMETIMECHEMILUMINESCENCE動(dòng)態(tài)信號(hào)－信號(hào)隨時(shí)間變化信號(hào)不與目標(biāo)蛋白濃度成比例關(guān)系ODYSSEY靜態(tài)信號(hào)－信號(hào)不隨時(shí)間變化信號(hào)和目標(biāo)蛋白濃度成比例關(guān)系Highconcentration/signalMediumconcentration/signalLowconcentration/signalSaturationBackground0,00,0INTENS
3、ITY紅外熒光定量Western－DEMO實(shí)驗(yàn)步驟Odyssey:膜+一抗孵育+熒光標(biāo)記抗體孵育+Odyssey掃描成像ECL:膜+一抗孵育+酶聯(lián)二抗孵育+底物顯色+UVP掃描成像實(shí)驗(yàn)?zāi)康臋z測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)染外源基因的表達(dá)狀況紅外熒光定量Western－DEMOMarkerS1S2S3S4MarkerS1S2S3S4Odyssey結(jié)果ECL結(jié)果信號(hào)強(qiáng)度5120104信號(hào)強(qiáng)度302623019（Odyssey軟件分析結(jié)果）結(jié)論Odyssey和ECL的相對(duì)靈敏度相差不大Odyssey紅外激光成像系統(tǒng)具有更好的線性關(guān)系和更精確的定量結(jié)果Odyssey掃描圖能
4、同時(shí)看到Marker和目標(biāo)蛋白，ECL看不到Marker10:4:2:1稀釋紅外熒光優(yōu)點(diǎn)－直接檢測(cè)，操作簡便膜上抗原一抗結(jié)合紅外標(biāo)記的二抗Odyssey直接掃描Infrareddye(IRD800,Alexa680)不需要底物不需要底片/暗室信號(hào)持久OdysseyVSECL流程ECLOdyssey1跑膠跑膠2轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜3封閉封閉4結(jié)合一抗、洗滌結(jié)合一抗、洗滌5結(jié)合酶標(biāo)記二抗、洗滌結(jié)合紅外染料標(biāo)記二抗、洗滌，成像6發(fā)光試劑盒7暗房曝光成像紅外熒光優(yōu)點(diǎn)－低背景NIRDyesBiomoleculesPorphyrinsVisibleFluorophores
5、PAHs1000nm800600400200Allothersequencers400-650nmLI-COR700-800nm硝酸纖維,聚偏氟乙?。≒VDF）,生物分子和尼龍等物質(zhì)在可見熒光范圍內(nèi)有很高的自身熒光。紅外熒光vs可見熒光膜背景信號(hào)紅外——背景低、SN更高紅外熒光VS化學(xué)發(fā)光定量線性范圍Odyssey成像呈現(xiàn)一個(gè)很好的線性（定量準(zhǔn)確）ECLODYSSEY紅外熒光VS化學(xué)發(fā)光線性寬的成像效果Odyssey曝光３０秒曝光１分鐘曝光５分鐘曝光１０分鐘Odyssey—雙色同時(shí)檢測(cè)800nm700nmOverlay兩套獨(dú)立激發(fā)檢測(cè)系統(tǒng)700通道
6、：680nm激發(fā)720nm檢測(cè)800通道：780nm激發(fā)820nm檢測(cè)應(yīng)用一：雙色－定量western檢測(cè)TargetproteinAnti-rabbit800channelNormalizertargetAnti-mouse700channel*Two-colordetectionrequiresprimaryantibodiesfromdifferenthosts應(yīng)用二：雙色－ERK的磷酸化Anti-ERKAnti-phosphoERKResultsOverlaidNon-StimulatedEGF-StimulatedNon-Stimulat
7、edEGF-StimulatedNon-StimulatedEGF-Stimulated700nmchannel800nmchannel700and800nm觀察EGF刺激后A431細(xì)胞中ERK1andERK2(p44/42MAPkinases)的磷酸化情況,一抗分別是兔抗ERK抗體和小鼠抗磷酸化ERK抗體,二抗用抗兔的IRDye800標(biāo)記的抗體(green),和抗鼠的Alexa680標(biāo)記的抗體(red)ERK:胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶EGF:表皮生長因子EMSA的簡介EMSA(ElectrophoreticMobilityShiftAssay)凝膠遷移實(shí)
8、驗(yàn)是研究DNA與蛋白質(zhì)或RNA與蛋白質(zhì)相互作用的常用技術(shù)。該技術(shù)是基于DNA/蛋白質(zhì)或RNA/蛋白質(zhì)復(fù)合體在聚丙烯酰胺凝膠
