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《從互作揭開lncRNA的秘密》由會(huì)員上傳分享,免費(fèi)在線閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫(kù)。
1、從互作揭開lncRNA的秘密近年來,長(zhǎng)非編碼RNA(lncRNA)得到了研究界的廣泛關(guān)注。如今,人們已經(jīng)鑒定了大量lncRNA,但大多數(shù)lncRNA的功能還未明確。為了解決這一問題,研究者們開始對(duì)lncRNA的互作蛋白進(jìn)行研究,并為此開發(fā)出了越來越多的分析工具。RIPRNA結(jié)合蛋白免疫沉淀技術(shù)又稱為RIP(RNAimmunoprecipitation),可以說是RNA版的ChIP(染色質(zhì)免疫沉淀),該技術(shù)能幫助人們分析與RNA結(jié)合蛋白相關(guān)的核酸。在RIP試劑盒(如Sigma的Imprint?RNAImmunoprecipitationkit)的幫助下,研究者們能夠利用
2、針對(duì)RNA結(jié)合蛋白的抗體,從細(xì)胞提取物中捕獲與蛋白相結(jié)合的RNA,再通過qPCR、芯片或二代測(cè)序技術(shù)對(duì)這些RNA進(jìn)行鑒定。不論是細(xì)胞質(zhì)還是細(xì)胞核,都會(huì)發(fā)生RNA與蛋白的相互作用。據(jù)ActiveMotif公司產(chǎn)品經(jīng)理KyleHondorp介紹,該公司的RNAChIP-IT?kit專用于研究RNA與細(xì)胞核染色質(zhì)的相互作用。該試劑盒通過甲醛固定來鎖定RNA-染色質(zhì)的互作,隨后對(duì)染色質(zhì)進(jìn)行超聲,并用DNAseI處理,最后利用磁珠進(jìn)行沉淀?!叭缒阊芯康氖强俶RNA,那么常規(guī)RIP試劑盒更合適一些,”Hondorp說,“常規(guī)RIP試劑盒可以處理所有細(xì)胞裂解物的總mRNA。”生產(chǎn)M
3、agnaRIP?RNA-bindingproteinimmunoprecipitationkit的EMDMillipore公司,也在開發(fā)專門針對(duì)染色質(zhì)的RIP試劑盒。預(yù)計(jì)這一新產(chǎn)品將于2014年第一季度發(fā)布,該產(chǎn)品有化學(xué)交聯(lián)與native兩種形式。據(jù)介紹,化學(xué)交聯(lián)可以分析究間接的蛋白-RNA相互作用,研究更高分子量的蛋白復(fù)合物。而native方法展現(xiàn)的是,親和力更高也更為直接的相互作用。除RIP以外,CLIP(UVcrosslinkingandimmunoprecipitation)也可以幫助人們捕捉與RNA結(jié)合蛋白互作的核酸。CLIP方案整合了交聯(lián)與核酸酶消化,不僅
4、允許對(duì)RNA-蛋白復(fù)合物進(jìn)行進(jìn)一步的純化(如凝膠電泳片段分離),還能夠揭示RNA-蛋白互作所發(fā)生的位點(diǎn)。最近人們又開發(fā)出了新型CLIP技術(shù)——iCLIP(individual-nucleotideresolutionCLIP),該技術(shù)能夠以單個(gè)堿基的分辨率,來展示RNA-蛋白互作的詳細(xì)信息。據(jù)倫敦大學(xué)學(xué)院的JernejUle教授介紹,CLIP與RIP的關(guān)鍵性差異,在于沉淀復(fù)合物后的凝膠純化步驟。CLIP技術(shù)可以給RNA-蛋白復(fù)合物的RNA末端帶上放射性標(biāo)記,并將這些復(fù)合物進(jìn)行SDS-PAGE分離,之后轉(zhuǎn)移到一張膜上。這樣的過程可以提高純化的特異性,減少非特異性的RNA
5、。蛋白酶消化可以將RNA從膜上解離下來,用于制備cDNA文庫(kù),以備測(cè)序分析?!癈LIP要比RIP麻煩一些,不過我認(rèn)為它很值得采用,”Ule說。“放射性信號(hào)的量及其特異性,能夠幫助我們提高cDNA文庫(kù)的質(zhì)量,最終得到準(zhǔn)確實(shí)用的數(shù)據(jù)。”ChIRP、CHART和RAP如果你對(duì)某種RNA感興趣,希望研究與其發(fā)生相互作用的蛋白,就需要采用新的實(shí)驗(yàn)方案。ChIRP(chromatinisolationbyRNApurification)、CHART(capturehybridizationanalysisofRNAtargets)和RAP(RNAantisensepurifica
6、tion)都基于同樣的理念,將與目標(biāo)RNA互補(bǔ)的寡核苷酸進(jìn)行生物素標(biāo)記,并由此捕獲相關(guān)蛋白。之后研究者可以通過二代測(cè)序或質(zhì)譜分析,來鑒定與RNA互作的蛋白,明確發(fā)生這些互作的基因組區(qū)域。據(jù)NEB的G.BrettRobb介紹,上述三種方法解決了當(dāng)今RNA生物學(xué)中的關(guān)鍵需求。目前,研究者們已經(jīng)鑒定了大量的lncRNA,但卻不清楚它們的功能。“解決這一問題的途徑之一,就是尋找與這些RNA發(fā)生互作的蛋白。”舉例來說,加州理工學(xué)院的MitchellGuttman和賓州大學(xué)的JeannieLee,就分別在使用RAP和CHART對(duì)XistlncRNA展開研究。據(jù)悉,目前ChIRP、
7、CHART和RAP技術(shù)都還沒有商業(yè)化。不過有一個(gè)試劑盒可以實(shí)現(xiàn)從已知RNA分離蛋白,即MBLInternational的RiboTrap系統(tǒng),該系統(tǒng)能夠利用體外轉(zhuǎn)錄的RNA(帶生物素標(biāo)記),從細(xì)胞提取物中分離與之結(jié)合的蛋白。讓互作變的清晰可見在體外確定了自己感興趣的RNA-蛋白互作之后,我們可以通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。這時(shí),Sigma公司的DuoLink?proximity-ligationassay就派上了用場(chǎng)。Sigma公司的AaronSin介紹道,DuoLink系列原本用于研究蛋白質(zhì)之間的相互作用。這一系統(tǒng)包括兩種標(biāo)記了寡核苷酸的抗體,這些抗體分