常用染料的激發(fā)與發(fā)射

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1、常用熒光染料的激發(fā)和發(fā)射波長FluorescentDye（熒光染料）Excitation（激發(fā)波長，nm）Emission（發(fā)射波長，nm）Cy2?489506GFP(RedShifted)488507YO-PRO?-1491509YOYO?-1491509Calcein494517FITC494518FluorX494519Alexa?488490520Rhodamine110496520ABI,5-FAM494522OregonGreen?500503522OregonGreen?488496524RlboGreen?500525RhodamineGreen?

2、502527Rhodamine123507529MagnesiumGreen?506531CalciumGreen?506533TO-PRO?-1514533TOTO-1514533ABI,JOE520548BODIPY?530/550530550Dil549565BODIPY?R542568BODIPY?558/568558568BODIPY?564/570564570Cy3?550570Alexa?546555570TRITC547572MagnesiumOrange?550575Phycoerythrin,R&B565575RhodaminePhalloid

3、in550575CalciumOrange?549576PyroninY555580RhodamineB555580ABI,TAMRA560582RhodamineRed?570590Cy3.5?581596ABI,ROX588608CalciumCrimson?590615Alexa?594590615TexasRed595615NileRed549628YO-PRO?-3612631YOYO?-3612631R-Phycocyanin618642C-Phycocyanin620648TO-PRO?-3642660TOTO-3642660DiDDilC’(5)6

4、44665Cy5?649670Thiadicarbocyanine651671Cy5.5675694備注：發(fā)射波長的顏色及頻率?顏色波長頻率紅色約625—740納米約480—405兆赫橙色約590—625納米約510—480兆赫黃色約565—570納米約530—510兆赫綠色約500—565納米約600—530兆赫青色約485—500納米約620—600兆赫藍(lán)色約440—485納米約680—620兆赫紫色約380—440納米約790—680兆赫???熒光染料的使用?吖啶橙：吖啶橙是最經(jīng)典的靈敏的熒光染料，它可對(duì)細(xì)胞中的DNA和RNA同時(shí)染色而顯示不同顏色的熒光，D

5、NA呈綠色熒光，RNA呈橙紅色熒光。EB:染色DNA和RNA熒光素雙醋酸酯(FDA)：FAD?本身無熒光,無極性,可透過完整的原生質(zhì)膜。一旦進(jìn)入原生質(zhì)體后,由于受到酯酶分解而產(chǎn)生具有熒光的極性物質(zhì)熒光素。它不能自由出入原生質(zhì)膜，因此有活力的細(xì)胞能產(chǎn)生熒光,無活力的原生質(zhì)體不能分解FAD無熒光產(chǎn)生。5mgFDA溶于1ml丙酮中,避光4℃下貯存,使用時(shí)取0.22mlFDA貯存液加入5ml0.65mol/L甘露醇中.使用時(shí),使最終濃度為0.01%。熒光染料Ho33342和若丹明123:?活細(xì)胞雙熒光染色觀察細(xì)胞核和線粒體。一般的生物染料不能穿透細(xì)胞膜，只有當(dāng)細(xì)胞被固定后

6、改變了細(xì)胞膜的通透性，染料才能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。但有些活體染料能進(jìn)入活細(xì)胞，并對(duì)細(xì)胞不產(chǎn)生毒性作用。熒光染料Ho33342和若丹明123都是活體染料。Ho33342能與細(xì)胞中DNA進(jìn)行特異的結(jié)合，若丹明123能與線粒體進(jìn)行特異的結(jié)合。采用兩種熒光染料的混合染液可對(duì)一個(gè)活細(xì)胞的核和線粒體同時(shí)染色。?熒光組化實(shí)驗(yàn)中應(yīng)注意的幾個(gè)問題：1．每種熒光染料，均有自己的最適PH值，此時(shí)熒光最強(qiáng)。當(dāng)pH改變時(shí)，不僅熒光強(qiáng)度減弱，而且波長將有所改變，因此熒光檢測(cè)時(shí)要在一定的PH值的緩沖液中進(jìn)行。2．一放熒光染色在20℃以下時(shí)熒光比較穩(wěn)定，溫度升高常出現(xiàn)溫度猝滅。3．在熒光觀察中，常因激發(fā)

7、光的增強(qiáng)而使樣品熒光很快衰竭，造成觀察和照相困難。為此最好用能量小的長波長光進(jìn)行觀察，需照相時(shí)再適當(dāng)增強(qiáng)激發(fā)光。4．一般熒光染液的濃度在萬分之一以下，甚至億萬分之一，也能使標(biāo)本著色。在一定的限度內(nèi)，熒光強(qiáng)度可隨熒光素的濃度增加而增強(qiáng)，但超過限度，熒光強(qiáng)度反而下降，這是由于熒光分子間的締合而使自身熒光猝滅所致。