《哺乳動物基因工程》PPT課件

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1、生物工程專業(yè)核心課程基因工程華東理工大學(xué)張惠展基因工程523416789基因工程的基本概念基因工程的基本原理基因工程所需的基本條件基因工程的操作過程目的基因的克隆與基因文庫的構(gòu)建大腸桿菌基因工程酵母基因工程哺乳動物基因工程高等植物基因工程D高等哺乳動物的基因轉(zhuǎn)移8哺乳動物基因工程C高等哺乳動物的載體系統(tǒng)B高等哺乳動物的受體系統(tǒng)A高等哺乳動物基因工程的基本概念E利用哺乳動物工程細(xì)胞生產(chǎn)重組蛋白A高等哺乳動物基因工程的基本概念8哺乳動物基因工程高等哺乳動物基因工程高等哺乳動物細(xì)胞基因表達(dá)技術(shù)高等哺乳動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)基因動物個體動物

2、工程細(xì)胞哺乳動物遺傳性狀改良藥物篩選研究評價模型人體基因治療蛋白多肽物質(zhì)大規(guī)模生產(chǎn)藥物篩選研究評價模型B高等哺乳動物的受體系統(tǒng)8哺乳動物基因工程高等哺乳動物細(xì)胞的生長特性高等哺乳動物受體細(xì)胞的條件高等哺乳動物受體細(xì)胞的遺傳標(biāo)記常用的高等哺乳動物受體細(xì)胞高等哺乳動物細(xì)胞的生長特性正常的哺乳類動物細(xì)胞具有下列四大生物學(xué)特征：錨地依賴性：細(xì)胞必須附在固體上或固定的表面才能生長分裂血清依賴性：細(xì)胞必須具有生長因子才能生長接觸抑制性：細(xì)胞與細(xì)胞接觸后，生長便受到抑制形態(tài)依賴性：細(xì)胞稱扁平狀，并有長纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上述特征使得正常的哺乳動物細(xì)

3、胞在體外培養(yǎng)中，一般只能存活50代且在培養(yǎng)皿上以平面的形式生長，即單層細(xì)胞生長。有時，正常細(xì)胞會改變某些特征而越過生理臨界點，繼續(xù)增殖并無限制分裂，這種狀態(tài)稱為細(xì)胞系形成，此時的細(xì)胞成為細(xì)胞系。高等哺乳動物受體細(xì)胞的條件以高效表達(dá)外源基因為目標(biāo)的高等哺乳動物受體細(xì)胞應(yīng)具備下列條件細(xì)胞系特征喪失細(xì)胞接觸抑制性和錨地依賴性特征，便于大遺傳穩(wěn)定性外源基因多次傳代后不至于丟失，易于長期保存合適的標(biāo)記便于轉(zhuǎn)化株的篩選和維持生長快且齊分裂周期短，生長均一，便于控制規(guī)模培養(yǎng)大多數(shù)正常的高等哺乳動物細(xì)胞并不能同時具備上述條件，癌細(xì)胞能安全性能

4、好不合成分泌致病物質(zhì)，不致癌滿足上述前四項要求，但在安全性能上有欠缺。高等哺乳動物受體細(xì)胞的遺傳標(biāo)記營養(yǎng)缺陷型的哺乳動物受體細(xì)胞5-磷酸核糖-1-焦磷酸（PRPP）次黃嘌呤核苷一磷酸（HMP）次黃嘌呤核苷（HR）GMPAMP尿嘧啶核苷一磷酸（UMP）胸腺嘧啶核苷一磷酸（TMP）胸腺嘧啶核苷（TR）嘌呤核苷酸生物合成途徑嘧啶核苷酸生物合成途徑次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HPRT）（TK）胸腺嘧啶核苷激酶氨基喋呤（AP）氨基喋呤（AP）從頭合成途徑補救合成途徑高等哺乳動物受體細(xì)胞的遺傳標(biāo)記營養(yǎng)缺陷型的哺乳動物受體細(xì)胞含有胸腺嘧啶核苷激

5、酶（TK）編碼基因缺陷的受體細(xì)胞（tk-）不能在含有次黃嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基上（HAT培養(yǎng)基）生長，載體上的標(biāo)記基因tk能與之遺傳互補含有次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HPRT）編碼基因缺陷的受體細(xì)胞不能在含有次黃嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基上（HAT培養(yǎng)基）生長，載體上的標(biāo)記基因hprt與之遺傳互補（hprt-）高等哺乳動物受體細(xì)胞的遺傳標(biāo)記哺乳動物受體細(xì)胞常見的遺傳選擇標(biāo)記遺傳標(biāo)記編碼產(chǎn)物篩選藥物作用機理APH-氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶G418APH滅活G418DHFR二氫葉酸還原酶氨甲喋呤DHFR變體

6、抗氨甲喋呤HPH-潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶潮霉素BHPH滅活潮霉素BTK-胸腺嘧啶核苷激酶氨基喋呤TK合成TMPXGPRT-黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶霉酚酸XGPRT合成GMPADA-腺嘌呤核苷脫氨酶腺嘌呤木酮糖苷ADA滅活Xyl-A常用的高等哺乳動物受體細(xì)胞迄今為止，用于醫(yī)療用品（藥物、抗體、診斷試劑）大規(guī)模生產(chǎn)的高等哺乳動物受體細(xì)胞主要還是中國倉鼠卵巢細(xì)胞（CHO），其優(yōu)勢有如下幾個方面：遺傳背景清楚，生理代謝穩(wěn)定與人的親緣關(guān)系接近，外源蛋白修飾準(zhǔn)確基因轉(zhuǎn)移和載體表達(dá)系統(tǒng)完善耐受剪切力，便于大規(guī)模培養(yǎng)被美國FDA確認(rèn)為安全的基因

7、工程受體細(xì)胞（GRAS）C高等哺乳動物的載體系統(tǒng)8哺乳動物基因工程人腺病毒DNA猴空泡病毒DNA（SV40）人乳多瘤病毒DNA（BKV）人牛痘病毒DNA人腺病毒DNA腺病毒科為線狀雙鏈DNA病毒，無包膜，呈二十面體，共有93個成員，分哺乳動物腺病毒和禽腺病毒兩個屬。目前已鑒定的人腺病毒腺病毒的生物學(xué)特性有6個亞屬，其中常用來構(gòu)建載體的主要是C亞屬的2型（Ad2）和5型（Ad5）病毒。腺病毒感染人細(xì)胞時呈裂解型，不致癌；但對嚙齒目動物來說，絕大多數(shù)的腺病毒成員均能致癌。人腺病毒DNA腺病毒的基因組DNAITRITRE1E2E3E

8、4IVa2VAL1L2L3L4L5腺病毒基因組DNA全長36kb，其包裝上限為原基因組的105%，DNA兩端各有一個反向重復(fù)序列（ITR）；E1-E4為早期基因，與病毒基因組的復(fù)制及晚期基因的表達(dá)調(diào)控有關(guān)，其中E3編碼晚期基因的調(diào)控因子，L1-L5為編碼病毒包裝蛋白的晚期基因