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1、柔嫩艾美耳球蟲TA4抗原基因cDNA在乳酸乳球菌中的克隆與表達張雪莉1，榮澤秦2，金崔尚3，何慶2，劉尚2（1.北京市農(nóng)林科學院畜牧獸醫(yī)研究所，北京100089；2.中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，北京100094；3.中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所，黑龍江哈爾濱150001)摘要：用PCR技術(shù)特異擴增了柔嫩艾美耳球蟲TA4抗原基因cDNA序列，克隆至質(zhì)粒pMD18-T中，獲得重組質(zhì)粒pMD18-T-TA4，采用KpnI/SacI雙酶切法及PCR確認正確后，將TA4基因cDNA目的片段亞克隆到乳酸乳球菌表達
2、載體pMG36n中，電穿孔法轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌LM0230，獲得重組質(zhì)粒pMG36n-TA4，采用KpnI/SacI雙酶切法及DNA測序證明cDNA序列完全正確。獲得TA4乳酸乳球菌表達株，經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果表明表達產(chǎn)物與預(yù)期大小的TA4蛋白分子量一致。關(guān)鍵詞：柔嫩艾美耳球蟲；TA4抗原基因cDNA；乳酸乳球菌；克隆與表達CloningandexpressionofTA4antigenfromEimeriatenellainLactococcuslactisZHANGLi1,QINZe-r
3、ong2,CUIShang-jin3,HEZhao-qing2,LIUShang-gao2(1.BeijingMunicipalAcademyofAgriculture&Forestry,Beijing100089,China;2.ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100094,China;3.HarbinVeterinaryResearchInstituteofChineseAcademyofAgriculturalSciences,Harbin100051,C
4、hina)Abstract:TA4antigencDNAofE.tenellawasamplifiedbyPCRandclonedintoavectorpMD18-T.ThepositiveplasmidcontainedTA4antigencDNAwasdetermindedbyrestrictionenzymeanalysisandPCR.TheplasmidpMD18-T-TA4andthevectorpMG36nwerebothdigestedbySacIandKpnI.ThecDNAenc
5、odingTA4antigenwassubclonedintopMG36nandtransferredintoLactococcuslactisLM0230byelectroporation.ItprovedthatthepositiverecombinantplasmidpMG36n-TA4containedcDNAencodingTA4antigenbyrestrictionenzymeanalysisandsequencedetermination.Inthepositivetransform
6、ants,theTA4antigenwasexpressedasafusionproteininLactococcuslactisLM0230,whichwasverifiedbySDS-PAGE.Keywords:Eimeriatenella;TA4Antigen;Lactococcuslactis;cloningandexpression球蟲子孢子表面的一種抗原TA4為25Ku的糖蛋白，是由8Ku和17Ku兩條多肽通過二硫鍵連接而成的。在孢子化開始后16ｈ～24ｈ合成[1]。Files[2]等利
7、用一段標記的寡聚核苷酸序列作探針，首先從基因文庫中篩選出了TA4抗原的基因（ta4），其后Brothers[3]利用ta4基因片段克隆出了該基因的全長cDNA，并將此在大腸桿菌中直接表達或作為β-半乳糖苷酶基因融合蛋白的一部分表達。近年來乳酸菌分子生物學進展迅速，探索一些有價值的基因在乳酸菌中克隆和表達已成為乳酸菌分子遺傳學研究的熱點[4~6]。因此，乳酸菌基因工程菌在功能食品、醫(yī)療保健及微生態(tài)制劑、人工口服疫苗等領(lǐng)域的應(yīng)用均具有誘人的前景[5]。本研究主要采用分子克隆技術(shù)，進行TA4抗原cDNA在
8、乳球菌中克隆和表達的基礎(chǔ)性工作，構(gòu)建TA4抗原的cDNA重組表達質(zhì)粒，并用電穿孔法導(dǎo)入乳球菌中，篩選到能表達TA4的工程乳酸菌，將外源基因表達產(chǎn)物與有益菌集為一體，為球蟲基因疫苗發(fā)展的新途徑奠定基礎(chǔ)。收稿日期：2005-04-13基金項目：本課題為國家自然科學基金資助項目（30070571）作者簡介：張雪莉（1973-），女，漢族，新疆烏魯木齊人，博士，助理研究員，主要從事畜禽傳染病的分子防制.51材料和方法1.1菌株和質(zhì)粒乳酸乳球菌（Lactococcuslacti
