擬南芥植物組織培養(yǎng)

《擬南芥植物組織培養(yǎng)》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫(kù)。

1、擬南芥組織培養(yǎng)一、種子消毒：方法一：將擬南芥種子置于1.5mleppendorf管(微量離心管)中，加入1ml蒸餾水，4C春化3d，70%（v／v）乙醇1min、7%（v／v）次氯酸鈉10min浸泡消毒，并用無(wú)菌水沖洗5次。方法二：在超凈工作臺(tái)內(nèi)，用無(wú)菌蒸餾水浸泡1min，然后用80％乙醇消毒90s，最后用無(wú)菌蒸餾水沖洗3～5次備用。消毒完畢的種子可以用200ul的tips吸去洗滌液，然后在超凈工作臺(tái)上揮發(fā)掉殘余水分、洗滌液。方法三、取野生型擬南芥種子放人離心管內(nèi)，75％乙醇清洗后，無(wú)菌蒸餾水清洗1—2次，轉(zhuǎn)入無(wú)菌離心管；5％次氯酸鈉

2、溶液浸泡5—6min，用無(wú)菌蒸餾水清洗3～4次，加入1ml無(wú)菌水，用移液槍接種。二、選用的培養(yǎng)基選用1/2MS培養(yǎng)基對(duì)種子進(jìn)行培養(yǎng)。（MS和1/2MS都可以，1/2MS就是大量元素減半，其他東西和ms培養(yǎng)基是一樣的量。糖可以加，會(huì)長(zhǎng)得比較好，但是也很容易污染。如果在平板上要生長(zhǎng)時(shí)間比較長(zhǎng)，需要做一些實(shí)驗(yàn)的，比如根的發(fā)育，最好不要加。）也可以用MS+30g／L蔗糖的固體培養(yǎng)基。（我想兩種培養(yǎng)基都接種上，比作對(duì)比確定好壞）。MS培養(yǎng)基配料表：三：接種方法擬南芥種子消毒后，用移液槍吸取擬南芥種子和水的混合物，均勻地在MS生長(zhǎng)培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿平

3、板上滴落，并使之形成兩條平行的直線。（如不行，可適當(dāng)添加瓊脂）。四、培養(yǎng)得無(wú)菌苗接種后置于光照培養(yǎng)箱(型號(hào)：GXZ．500C；培養(yǎng)光照條件為16小時(shí)光照，8小時(shí)黑暗，培養(yǎng)溫度為22℃中豎直培養(yǎng)。3天后即可取材用于器官離體再生實(shí)驗(yàn)。萌發(fā)5天后，在超凈工作臺(tái)中，用鑷子將苗移栽到裝有1／2MS培養(yǎng)基的50ml三角瓶中（每瓶4--6棵，視情況而定），于短日照條件下培養(yǎng)30天左右獲得無(wú)菌苗。（短日照光照條件8小時(shí)光照，16小時(shí)黑暗，長(zhǎng)日照光照條件為16小時(shí)光照，8小時(shí)黑暗，培養(yǎng)溫度均為22℃。）此處獲得無(wú)菌苗的時(shí)間有異議，應(yīng)該為2--3周？五、

4、外植體的選取B5+5mg／L2，4-D+0.5mg／LKT培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織,蓮座葉作外植體出愈慢，出愈率低，愈傷組織質(zhì)量較差；葉柄、下胚軸和根作外植體出愈快，且愈傷組織質(zhì)量好，后期易分化。由于葉柄、下胚軸相對(duì)較短，難于收集，為了便于操作，減少污染，試驗(yàn)中采用根作為外植體誘導(dǎo)愈傷組織和誘導(dǎo)分化試驗(yàn)。所取外植體的大小為5mm左右，不宜過(guò)大或過(guò)小。滴落種子形成的兩條直線位于平皿的上半部，可以避免伸長(zhǎng)的根被培養(yǎng)基中滲出的水分所淹。無(wú)菌苗的苗齡太短不易得到足夠多的外植體，苗齡太長(zhǎng)則外植體脫分化的時(shí)間明顯延長(zhǎng)，最適苗齡以2--3周為宜。六、胚

5、性和非胚性愈傷組織的誘導(dǎo)1、以MS為誘導(dǎo)培養(yǎng)基,附加2,4一D2mg/L,KT、NAA各0.5mg/L,水解酪蛋白300mg/L，6%蔗糖，0.7瓊脂，PH5.82、接種幼穗長(zhǎng)度為1--2cm左右,置于28℃恒溫箱內(nèi)暗培養(yǎng)。形態(tài)鑒定：幼穗接種后,一星期左右開(kāi)始長(zhǎng)出愈傷組織。將其置于解剖鏡下觀察可以發(fā)現(xiàn)兩種不同類(lèi)型的愈傷組織。一類(lèi)質(zhì)地緊密,有光澤,乳白色或淺黃色,愈傷組織表面有許多光滑的球形突起,呈顆粒狀。每個(gè)球狀體用鑷子很易從愈傷組織上分離下來(lái)。這種愈傷組織被認(rèn)為是胚性愈傷組織。另一類(lèi)質(zhì)地疏松且濕軟,常伴有粘液物質(zhì),沒(méi)有光澤,黃色至褐

6、色,此類(lèi)愈傷組織沒(méi)有一定的形態(tài)結(jié)構(gòu)。（栽培稻）NB培養(yǎng)基可明顯提高擬南芥的愈傷組織出愈率，且以NB培養(yǎng)基為基礎(chǔ)配以2，4一D2．0mg／L和6一BA1．0mg／L時(shí)，擬南芥的愈傷組織生長(zhǎng)狀態(tài)最好。MS+2,4?D0.5mg/L+6?BA0.3mg/L,誘導(dǎo)率達(dá)87.5%,且愈傷組織生長(zhǎng)較好。培養(yǎng)基中添加5g/L活性炭能有效地抑制外植體褐化。MS培養(yǎng)基對(duì)秈稻種胚愈傷的誘導(dǎo)培養(yǎng)效果較好,NB培養(yǎng)基則更適合粳稻種胚愈傷的誘導(dǎo)培養(yǎng)。誘導(dǎo)繼代培養(yǎng)基為NB(N6培養(yǎng)基的大量元素,B5培養(yǎng)基的微量元素和有機(jī)物)、MS和LS基本培養(yǎng)基,輔加2,4-D

7、(2.5mg/L),6-BA(0.5mg/L),30g/L蔗糖,10g/L瓊脂或3g/L植物膠。BA對(duì)于愈傷組織誘導(dǎo)不可缺少，但其濃度太高易產(chǎn)生玻璃化；NAA單獨(dú)使用利于生根，配合6一BA使用利于分化芽；獲得最適愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為Ms+O．50mg／L6-BA+0．10me,／LNAA，愈傷組織誘導(dǎo)率可達(dá)100％。NB培養(yǎng)基用途：用于植物組織培養(yǎng)配方：（mg/L）硝酸鉀(KNO3)硫酸銨((NH4)2SO4)氯化鈣(CaCl2·2H2O)磷酸二氫鉀(KH2PO4)硫酸鎂(MgSO4·7H2O)硼酸(H3BO3)硫酸錳(MnSO4·4

8、H2O)硫酸鋅(ZnSO4·7H2O)鉬酸鈉(Na2MoO4·2H2O)硫酸銅(CuSO4·5H2O)氯化鈷(CoCl2·6H2O)碘化鉀(KI)乙二胺四乙酸二鈉(Na2·EDTA)硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)肌醇(