《核酸電泳》課件

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1、核酸物質提取與電泳天然DNA的制備總DNA：主要指基因組DNA(genomicDNA)，即細胞核內的染色體DNA分子。如果將螺旋狀的DNA分子拉直，其長度將超過人的身高，這個特點使其對機械力十分敏感。目前可以成功地測出它的一級結構，但仍難以分離出它的完整分子。特點：一條染色體為一個DNA分子，高等生物核DNA的長度與直徑的比值很大，DNA分子呈極不對稱的線狀結構．1.天然DNA的來源(1)染色體DNA(2)病毒與噬菌體(3)質粒DNA(4)線粒體與葉綠體2.DNA的提取細胞的破碎物理方式：超聲波法、勻漿法、液氮破碎法、煮沸破碎法、微波破碎法等；特點：容易導致DNA鏈的斷裂.酶解法：蛋

2、白酶K裂解法（常和SDSCTAB法一起裂解細胞）、溶菌酶裂解法（常和熱處理一起裂解細胞）等；化學法：CTAB裂解法、SDS裂解法等等；特點：簡單易行；能滿足分子生物學研究的需要。超生波液氮總DNA的提取：去除多糖、脂類、蛋白等，添加Rnase降解RNA后得到的就是DNA去除多糖：CTAB、PVP、高鹽溶液等去除脂類：SDS、CTAB等去除蛋白：SDS、蛋白酶Ｋ、酚／氯仿等質粒DNA的提取破壞細胞壁溶菌酶、強堿和十二烷基磺酸鈉(SDS)裂解細胞膜十二烷基磺酸鈉(SDS)、TritonX-1001、蛋白質及其它雜質的去除SDS使蛋白形成不溶物，沉淀出來高濃度鹽離子(KCl)使變性蛋白、

3、多糖、細胞碎屑等沉淀出來2、細菌線形染色體DNA的去除強熱、堿處理時，細菌線性染色體DNA變性，當快速降溫、加入酸中和時，已變性的細菌線性染色體DNA變性不能快速復性，與其它雜質纏繞而沉淀出來質粒DNA雙鏈可快速恢復原狀,重新形成超螺旋分子,并以溶解狀態(tài)存在于液相中3.DNA的純化和濃縮(1)乙醇(2)異丙醇(3)聚乙二醇(PEG600)工作區(qū)域應與普通微生物實驗的區(qū)域隔開！RNA的提取分離1.應與進行普通微生物實驗的區(qū)域分離開2.使用標有“無RNA酶”的商品試管,吸頭,溶液和水.（通常新的無菌處理過的塑料試管和吸管無RNA酶）3.雙蒸水(ddH2O)和溶液應該用RNA酶的抑制劑DE

4、PC(焦碳酸二乙酯)進行處理:a、每100mL溶液或水中加入0.1mLDEPC原液,放在搖床上充分混勻并在37℃下作用數(shù)小時.b、將溶液高壓滅菌至少15min使DEPC失活4.分離RNA以前,將一些實驗室玻璃制品置于烤箱在300℃烘烤至少4h以滅活核酶.如有可能,將其他設備也滅菌處理前期準備:1.在Trizol試劑的保護下，勻漿組織，靜置裂解細胞釋放內含RNA，Trizol試劑對RNA有保護作用，能抑制RNA酶的活性，并且同時有裂解細胞的作用。2.將勻漿液中加入苯酚，去除裂解液中的脂類，蛋白和DNA，離心后取出上清液，里面含有RNA，而雜質留在苯酚中3.在上清液中加入等體積異丙醇，混

5、勻后，靜置片刻，離心，將RNA沉淀于管底。棄上清，用75%乙醇洗滌沉淀，離心。去上清，將沉淀在真空干燥器中烘干RNA提取關鍵步驟核酸電泳NucleicAcidGelElectrophoresis正極負極帶負電粒子帶正電粒子電泳(electrophoresis)：帶電顆粒在電場的作用下，向著與其電性相反的電極移動的現(xiàn)象。許多重要的生物分子如氨基酸、多肽、蛋白質、核苷酸、核酸等都含有可電離基團，在非等電點條件下均帶有電荷。凝膠電泳的原理：電泳的遷移率：電泳分子在電場作用下的遷移速度。（當一種分于被放置在電場當中時、它們就會以一定的速度移向適當?shù)碾姌O）。1、同電場的強度和電泳分子本身所攜帶

6、的凈電荷數(shù)成正比。（電場強度越大電泳分子所攜帶的凈電荷數(shù)量越多，遷移的速度越快。反之則較慢）2、電泳的遷移率與分子的摩擦系數(shù)成反比。電泳時會使用一種無反應活性的、穩(wěn)定的支持介質，如瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠等，降低了對流運動。數(shù)據(jù)表明：摩擦系數(shù)是分子的大小、極性及介質粘度的函數(shù)．電泳的原理：根據(jù)分子大小的不同、構型或形狀的差異以及所帶凈電荷的多寡，可以通過電泳將蛋白質或核酸分子混合物中的各種成分彼此分離。19世紀初(1808)發(fā)現(xiàn)了電泳現(xiàn)象。當時多用于膠體化學的分析1937年Tiselius利用U形玻管進行血清蛋白電泳，以界面折光率差別分離蛋白呈4-5高峰即界面電泳1948年Wiel

7、and等發(fā)明以濾紙作為支持物，使電泳技術大為簡化近30年來，由于采用多種新型支持物，儀器裝置亦得到不斷改進，因此出現(xiàn)了許多新型的電泳技術（一）電泳的分類：1、按分離原理分為：自由電泳如：顯微電泳區(qū)帶電泳穩(wěn)態(tài)電泳（置換電泳）：如等電聚焦和等速電泳特點：分子顆粒的電泳遷移在一定時間后達到穩(wěn)態(tài)自由界面電泳非自由界面電泳自由電泳由于設備復雜，操作時間很長，不能完全地分離混合物的各個組成等一些不可克服的缺點，已逐漸為區(qū)帶電泳所代替檢測微粒電荷的符號、數(shù)量及電泳率，能