《液相色譜培訓(xùn)》PPT課件

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1、液相色譜基礎(chǔ)知識一、色譜起源石油醚碳酸鈣顆粒色素色譜組分液相色譜：以液體作為流動相的色譜分離方法適用于高沸點(diǎn)、大分子、強(qiáng)極性和熱穩(wěn)定性差的化合物的分析流動相具有運(yùn)載樣品分子和選擇性分離的雙重作用氣相色譜：以氣體作為流動相的色譜分離方法適用于沸點(diǎn)較低、熱穩(wěn)定性好的中小分子化合物的分析流動相只起運(yùn)載樣品分子的能力液相色譜基礎(chǔ)知識HPLC的分離類型正相色譜(NP-HPLC)反相色譜(RP-HPLC)反相離子對色譜(RPIC)離子交換色譜(IEC)空間排阻色譜(SEC)手性化合物分離模式(Chiralseparationmode)液相色譜按兩相極性不同分為:正相色譜反相色譜化合物保留

2、時間隨流動相配比的變化不同極性的化合物出峰順序正相HPLC色譜柱硅膠型氰基型氨基型糖類分析二醇基型蛋白質(zhì)分析SilicagelSiSi-Si-CH2CH2CH2CN-Si-CH2CH2CH2NH2-Si-CH2CH2CH2OCH(OH)-CH2(OH)ModifiedSi反相HPLC色譜柱C18(ODS)typeC8(octyl)typeC4(butyl)typePhenyltypeTMStypeCyanotype-Si-C18H37SiNon-polarproperty色譜柱:非極性溶劑:極性水/甲醇/乙腈反相色譜液相色譜流程圖輸液泵進(jìn)樣器色譜柱柱溫箱檢測器溶劑數(shù)據(jù)處理流動

3、相流動相選擇注意事項(xiàng)：純度：采用“HPLC”級溶劑避免使用會引起柱效損失或保留特性變化的溶劑對試樣有適宜的溶解度溶劑粘度要小與檢測器相匹配流動相配制時的順序溶劑等級水的等級純化水蒸餾水去離子水波長(nm)純化水去離子水因?yàn)椴患兾锏拇嬖?，去離子的吸光率較高純化水中去除了無機(jī)和有機(jī)的污染物吸光率水/MeOH梯度ODS柱鬼峰GradientCurve1ml/min,0-100%MeOHover10minsandholdfor15mins.溶劑等級鬼峰的出現(xiàn)溶劑等級溶劑的等級HPLC級優(yōu)級純分析純都經(jīng)過蒸餾和0.45um的過濾(除纖維毛,未溶解的機(jī)械顆粒)優(yōu)級純的純度比分析純大,但里

4、面含有防腐劑和抗氧化劑HPLC級經(jīng)過0.22um的過濾,且除去有紫外吸收的雜質(zhì)微量分析、梯度洗脫甲醇乙睛正己烷分析純級和HPLC級溶劑的吸光度比較圖溶劑等級溶劑前處理過濾：0.45um或更小孔徑濾膜目的：除去溶劑中的微小顆粒，避免堵塞色譜柱，尤其是使用無機(jī)鹽配制的緩沖液。過濾膜種類水系過濾膜有機(jī)系過濾膜30mm內(nèi)徑：適用于大進(jìn)樣量的過濾，由0.22μm和0.45μm兩種規(guī)格,材料有纖維素,醋酸纖維,聚四氟乙烯。處理樣品體積少于50μl。13mm內(nèi)徑：適用于范圍廣的過濾，由0.22μm和0.45μm兩種規(guī)格,材料為纖維素。3mm內(nèi)徑：適用于小進(jìn)樣量的過濾，由0.22μm和0.4

5、5μm兩種規(guī)格。處理樣品體積為7μl。樣品過濾頭的類型：濾膜類型：聚四氟乙烯濾膜：適用于所有溶劑，酸和鹽，并無任何可溶物。醋酸纖維濾膜：不適用于有機(jī)溶劑，特別適用于水基溶液，推薦用于蛋白質(zhì)和其相關(guān)樣品。尼龍66濾膜：適用于絕大多數(shù)有機(jī)溶劑和水溶液，可用于強(qiáng)酸,70%乙醇、二氯甲烷、不適用于二甲基甲酰胺。再生纖維素濾膜：具有蛋白吸收低，同樣適用水溶性樣品和有機(jī)溶劑。溶劑前處理脫氣目的：除去流動相中溶解或因混合而產(chǎn)生的氣泡一般混合溶劑中能容納的空氣量往往要比單個溶劑所能容納的空氣總量要小氣泡對測定的影響：1）柱壓波動，流量偏小2）基線波動返回流路中形成氣泡引起的問題改變保留時間和

6、峰面積流動相中形成氣泡對液流的不良影響泵中形成氣泡使液流波動峰變形柱中氣泡形成和累積使流動相繞流尖峰或鋸齒狀噪聲檢測池中氣泡形成和累積產(chǎn)生基線噪聲輸液泵輸液泵控制方式：恒流控制恒壓控制輸液泵類型：注射泵柱塞往復(fù)泵隔膜泵柱塞往復(fù)泵單向閥馬達(dá)和凸輪柱塞桿柱塞桿密封圈泵頭10-100uL柱塞往復(fù)泵優(yōu)點(diǎn)壓力脈動小易于更換溶劑缺點(diǎn)需要更換柱塞桿密封圈島津VP系列輸液泵目的單元流速范圍特性和應(yīng)用分析LC-10ADVP0.001-9.999無脈動，適于半微量LC和LC-MSLC-10ATVP0.001-9.999非凡的耐用性，適于常量分析*所有單元都既可做高壓梯度又可做低壓梯度等度洗脫輸液

7、泵進(jìn)樣器色譜柱柱溫箱檢測器單一或混合溶劑梯度洗脫A泵進(jìn)樣器色譜柱柱溫箱檢測器B泵AB時間B濃度分析時間長分離度差MeOH/H2O=6/4MeOH/H2O=8/2(column:ODStype)等度洗脫95%30%MeOH濃度梯度洗脫梯度洗脫：優(yōu)點(diǎn)：可提高分離度、縮短分離時間、降低最小檢測量和提高分離精度注意事項(xiàng)：溶劑的純度要高，否則梯度洗脫的重現(xiàn)性差梯度混合的溶劑互溶性要好梯度洗脫應(yīng)使用對流動相組成變化不敏感的選擇性檢測器（如紫外吸收檢測器或熒光檢測器），而不能使用對流動相組成變化敏感的通用型檢測器（如