《細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察》PPT課件

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1、第三章細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察技術(shù)一、活體細(xì)胞的觀察和攝影技術(shù)1.倒置顯微鏡：P60圖3-3（提問光鏡使用注意）適用：觀察貼壁生長的培養(yǎng)中細(xì)胞構(gòu)造特點(diǎn)：因物鏡置于觀察標(biāo)本下方而得名技巧：調(diào)弱光亮度，集光器稍遠(yuǎn)些，增大光線反差，對正光軸；攝影時，使觀察物稍偏遠(yuǎn)離焦點(diǎn)，照片會更清晰。底片選用正片，反差大2.相差顯微鏡P62圖3-4適用：可增強(qiáng)活細(xì)胞同背底反差，幫助看清細(xì)胞的輪廓和細(xì)胞內(nèi)細(xì)微結(jié)構(gòu)，如：核仁、染色質(zhì)、線粒體等。構(gòu)造特點(diǎn)：有兩個附加構(gòu)件：相差接物鏡：其光學(xué)系統(tǒng)中有一個光環(huán)透鏡相差聚光器：內(nèi)有數(shù)個相位板，使用時與物鏡倍數(shù)一致技巧：細(xì)胞培養(yǎng)瓶質(zhì)地均勻透明較好，最好用塑料瓶

2、；觀察攝影時，瓶壁要擦凈；光軸對正，照明度適宜，摸索試調(diào)至最佳3.熒光顯微鏡P67圖3-6適用：觀察細(xì)胞內(nèi)天然的熒光物質(zhì)，如維生素、脂褐素、核黃素等，也可觀察可與熒光染料結(jié)合的細(xì)胞組分。構(gòu)造特點(diǎn)：與普通光鏡比，區(qū)別在于用高壓汞燈光源，波長可激發(fā)熒光物質(zhì)產(chǎn)生熒光；濾光片不同。技巧：觀察必須是自發(fā)熒光或經(jīng)熒光染色的標(biāo)本；選用效果最好的濾光片；熒光標(biāo)本易褪色，不能長期保存，觀察操作要迅速，作好記錄；儀器的高壓汞燈光源啟動后15分鐘內(nèi)不得關(guān)閉，關(guān)閉后，燈冷卻后方可再起動，否則壽命大減，長時間觀察標(biāo)本時，需帶護(hù)目鏡。4.暗視野顯微鏡P64圖3-5適用：觀察記錄活細(xì)胞或細(xì)胞器的

3、運(yùn)動軌跡，提高分辨率構(gòu)造特點(diǎn)：只有聚光器不同于普通顯微鏡，設(shè)有一個中央遮光板使照明光線不能直射。標(biāo)本進(jìn)入目鏡，只許標(biāo)本散射光進(jìn)入目鏡技巧：物鏡的數(shù)值孔徑必小于聚光器的數(shù)值孔徑；蓋玻片，載玻片應(yīng)清潔無痕；聚光鏡和載玻片之間加香柏油，保證效果。二.顯微攝影技術(shù)p681.概念：顯微攝影術(shù)是利用顯微攝影裝置拍攝顯微鏡視野的物象的技術(shù)。2.技術(shù)類型：膠片相機(jī)攝像數(shù)碼相機(jī)攝像CCD圖像采集三者前期操作一致，但成像和圖像存儲原理不同。3.圖像記錄原理：膠片相機(jī)攝像：顯微攝影時，光線自標(biāo)本片的微小物件射入物鏡后，造成一個倒立的放大實(shí)像，經(jīng)目鏡進(jìn)一步放大后，投射在照相底片上，使底片感

4、光而記錄下顯微鏡視野下物象。數(shù)碼相機(jī)攝像：是以數(shù)字的形式用電子設(shè)備儲存圖像。拍照后，可通過數(shù)據(jù)線將所拍攝圖像傳輸?shù)诫娔X，也可將相機(jī)的存儲卡取出，通過讀卡器將拍攝的圖像傳輸?shù)诫娔X上。數(shù)碼相機(jī)攝像原理與CCD圖像采集器相同。CCD圖像傳感器：即CCD(chargecopledDevice,感光耦合組件）CCD的組成結(jié)構(gòu)有三個層次：上層：聚光鏡片（增光鏡片）中層：一個類似馬賽克的網(wǎng)絡(luò)（分色網(wǎng)絡(luò)）下層：墊在下層的電子線路矩陣（感應(yīng)線路是可記錄光線變化的半導(dǎo)體）CCD工作方式之一：當(dāng)數(shù)碼相機(jī)的快門開啟，來自影像的光線穿過，這些馬賽克會讓感光點(diǎn)的=氧化硅材料釋放出電子（正電）與

5、電洞（負(fù)電）。經(jīng)由外部加入電壓，這些電子和電洞會被轉(zhuǎn)移到不同極性的另一個硅區(qū)暫存。電子數(shù)的多寡和曝光點(diǎn)所接受的光量成正比。在一個影像最明亮部位，可有十萬電子被積存起來。CCDIMAGESENSOR外形彩色CCD的組成結(jié)構(gòu)分圖CCD的三層結(jié)構(gòu)：上：增光鏡片、中：色塊網(wǎng)格下：感應(yīng)線路由微型鏡頭、馬賽克分色網(wǎng)格，及墊于最底層的電子線路矩陣所組成4.拍攝技術(shù)步驟：膠片相機(jī)拍攝：p69-74(生物教研室李相偉）數(shù)碼相機(jī)拍攝：p74-75(同上）CCD圖像采集：（病理教研室姚海濤（實(shí)驗(yàn)中心劉君星）5.縮時顯微攝影術(shù)適用：記錄細(xì)胞或細(xì)胞器連續(xù)動態(tài)變化過程正常時態(tài)連續(xù)拍照縮時逐格拍

6、照主要裝備：倒置顯微鏡，16mm攝影機(jī)，自控縮時啟動拍攝裝置。原理：縮時間隔時間：目標(biāo)物實(shí)際活動時間X1/24影片排成后要求放鏡時間=3600秒／10秒x1／24=15秒所以，每隔15秒攝取1張照片。三、光鏡下的固定細(xì)胞觀察法（組胚，病理）細(xì)胞器培養(yǎng)皿內(nèi)鋪蓋片單層培養(yǎng)取蓋片細(xì)胞懸液離心沉淀涂片固定染色觀察拍照（固定劑，染色劑知識介紹）固定劑的作用：穿透，固定，保形，防腐固定劑的選擇：P83細(xì)胞內(nèi)組分的差異染色。染色劑的選擇：Giemsa—染色體桃紅色。本書P84Feulgen—DNA紫紅色，細(xì)胞質(zhì)綠色。鄂P141吖啶橙—RNA紅色，DNA亮綠色。本書P86蘇木精-伊

7、紅（HE)—細(xì)胞核藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)紅色本書P85過碘酸席夫—細(xì)胞內(nèi)含糖原區(qū)—紫紅色。章P58蘇丹紅III—細(xì)胞內(nèi)含脂肪區(qū)—橘紅色。章P59鬼筆環(huán)肽—溦絲染色。章P59免疫熒光法—溦管染色。章P60聯(lián)苯胺+H2O2—過氧化氫體染色。小章P37詹納斯綠B—活體細(xì)胞線粒體。小章P43四、激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)（實(shí)驗(yàn)中心）1.概念和原理P76lasterscanningconfocalmicroscopeLSCM激光共聚焦顯微鏡是20世紀(jì)80年代以來發(fā)展起來的一項(xiàng)細(xì)胞生物學(xué)和高分子材料科學(xué)領(lǐng)域的高科技分析儀器。其在傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡基礎(chǔ)上，利用激光作為光源，經(jīng)照明針孔可形成點(diǎn)