《細胞科學報告選題》PPT課件

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1、轉(zhuǎn)基因動物轉(zhuǎn)基因動物1982年美國華盛頓大學Palmiter等將大鼠生長激素基因?qū)胄“资蟮氖芫牙铮賹⑦@一受精卵植入借腹懷孕的母鼠體內(nèi)，生下一個比正常體格大一倍的“超級小鼠”。按照轉(zhuǎn)基因小鼠的思路，人們已經(jīng)成功的獲得了轉(zhuǎn)基因大鼠、雞、山羊、綿羊、豬、兔、牛、蛙、魚等。轉(zhuǎn)基因動物技術概念研制的方法技術的優(yōu)點發(fā)展前景含外源基因的載體基因微注射移植受精卵小鼠出生轉(zhuǎn)基因鼠的檢測繁殖后代轉(zhuǎn)基因動物一、轉(zhuǎn)基因動物概述（一）轉(zhuǎn)基因動物概念轉(zhuǎn)基因動物是指通過基因工程對DNA進行體外操作，添加或刪除一個特殊的DNA序列，然后導入早期的胚胎干細胞中，產(chǎn)生遺傳結(jié)構得以修飾的動物，其改變的性狀可以遺傳給

2、后代。這些改變包括：（1）外源DNA片段至少整合到一條染色體上；（2）由于外源DNA的插入使任何一個基因發(fā)生改變；（3）由于外源DNA的插入或內(nèi)源基因的刪除使染色體發(fā)生重排；（4）有意識地導入可以持久存在的遺傳實體。（二）轉(zhuǎn)基因動物的命名1．符號(1)一個轉(zhuǎn)基因符號由以下三部分組成：TgX(YYYYYY)＃＃＃＃＃Zzz，TgX=方式；(YYYYYY)=插入片段標示；＃＃＃＃＃=實驗室指定序號；Zzz=實驗室注冊代號；(2)方式轉(zhuǎn)基因符號通常冠以Tg字頭。隨后的一個字母（X）表示DNA插入的方式：H代表同源重組；R代表經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染的插入；N代表非同源插入。（3）插入片段標示

3、An匿名序列；Ge基因組；Im插入突變；Nc非編碼序列；Rp報告基因；Sn合成序列；Et增強子捕獲裝置；Pt啟動子捕獲裝置。2.舉例C57BL/6J-TgN(CD8Ge)23Jwg：來源于美國杰克遜研究所（J）的C57BL/6品系小鼠被轉(zhuǎn)入人的CD8基因組（Ge）；轉(zhuǎn)基因在JonW.Gordon(Jwg)實驗室完成，獲取于一系列顯微注射后得到的序號為23的小鼠。二、轉(zhuǎn)基因動物的基本原理和方法（一）基本原理將改建后的目的基因用顯微注射等方法注入實驗動物的受精卵，然后將此受精卵再植入受體動物的輸卵管中，使其發(fā)育成攜帶有外源基因的轉(zhuǎn)基因動物，人們可以通過轉(zhuǎn)入外源基因培育優(yōu)良品種的工程動物等

4、。1.外源目的基因的分離2.外源目的基因與轉(zhuǎn)性基因表達啟動子、增強子、報告基因等構件的拼接重組3.重組DNA導入生殖細胞或胚胎干細胞4.胚胎移植技術5.鑒定及篩選6.目的基因整合率及表達效率的檢測（二）轉(zhuǎn)基因動物的關鍵技術1.采取受精卵采取受精卵的方法分為獲得自然排卵的受精卵的方法和以激素誘發(fā)排卵的方法，還有采取未受精卵，然后在體外受精的方法。2.向受精卵雄性原核注入DNA溶液通過微分干涉顯微鏡觀察受精卵，會看到兩個大的原核。兩個核不久即可融合，接著核膜消失。雄性原核要比雌性原核能容納更多的DNA溶液，一般是向雄性原核注入DNA溶液。3.向假妊雌小鼠移植（1）假妊雌小鼠的制作（2）將

5、操作卵移植至輸卵管4.轉(zhuǎn)基因動物的檢測Ⅰ顯微注射法Ⅱ逆轉(zhuǎn)錄病毒法原理：逆轉(zhuǎn)錄病毒的核酸為一條單鏈RNA分子，其基因由兩部分組成，一是順式作用序列，為病毒復制和整合所必需；二是反式作用序列，編碼病毒的包裝蛋白。將外源基因取代反式作用序列構建成重組載DNA。另外將包裝蛋白基因?qū)雽ｉT的細胞并使之整合到染色體上，形成包裝細胞。如果重組病毒DNA導入這種包裝細胞中，病毒包裝蛋白能將DNA包裝成具有感染力的重組蛋白顆粒，能浸染動物細胞而將重組DNA引入宿主細胞。Ⅱ逆轉(zhuǎn)錄病毒法步驟：1.逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構建2.選擇和培養(yǎng)包裝細胞系3.重組病毒DNA導入包裝細胞4.收集重組病毒顆粒5.感染胚細胞，

6、使細胞轉(zhuǎn)化此法是目前制備轉(zhuǎn)基因雞最有效和最成功的方法。Ⅲ胚胎干細胞法胚胎干細胞是在人（哺乳動物）胚胎發(fā)育早期——囊胚（受精后約5—7天）中未分化的細胞。囊胚含有約140個細胞，外表是一層扁平細胞，稱滋養(yǎng)層，可發(fā)育成胚胎的支持組織如胎盤等。中心的腔稱囊胚腔，腔內(nèi)一側(cè)的細胞群，稱內(nèi)細胞群，這些未分化的細胞可進一步分裂、分化，發(fā)育成個體。由于內(nèi)細胞群可以發(fā)育成完整的個體，因而這些細胞被認為具有全能性。當內(nèi)細胞群在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)時，我們稱之為胚胎干細胞。利用胚胎干細胞法制備轉(zhuǎn)基因小鼠的過程1.3.5天的孕鼠2.分離胚細胞3.轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中培養(yǎng)4.分離內(nèi)層細胞團5.收集干細胞克隆6.酶處理解散細胞

7、7.培養(yǎng)干細胞8.轉(zhuǎn)染干細胞9.植入代孕母鼠體內(nèi)在胚胎干細胞基礎上的基因打靶技術2007年諾貝爾生理學或醫(yī)學獎分別授予兩名美國人馬里奧·卡佩基、奧利弗·史密斯和一名英國人馬丁·埃文斯，以表彰他們在“基因靶向”技術方面的突出貢獻。諾貝爾獎評審委員會發(fā)布的公報說，三位科學家“在涉及胚胎干細胞和哺乳動物ＤＮＡ重組方面有著一系列突破性發(fā)現(xiàn)”，為“基因靶向”技術的發(fā)展奠定了基礎。在“基因靶向”技術的幫助下，科學家可以使小鼠體內(nèi)的特定基因喪失功能。此類“基因敲除”試驗