凍干血小板在深Ⅱ度燙傷大鼠模型中對(duì)創(chuàng)面愈合作用分析

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1、萬(wàn)方數(shù)據(jù)碩士學(xué)位論文目的將血小板濃縮液進(jìn)行凍干處理后制備成FDP，并將其應(yīng)用于大鼠深I(lǐng)I度燙傷創(chuàng)面的愈合，觀察FDP使用后創(chuàng)面的愈合情況，以驗(yàn)證FDP外用治療燙傷的療效，為其進(jìn)一步應(yīng)用于臨床提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法1、FDP的制備(1)PRP的制備采用無(wú)償獻(xiàn)血者捐獻(xiàn)的全血，按國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)合格后進(jìn)行血小板分離，1500xg離心10min分離出上層富含血小板血漿，再將此富含血小板血漿經(jīng)3000xg離心20min，分離出上層貧血小板血漿和下層富血小板血漿，用貧血小板血漿來(lái)調(diào)整后者血小板的濃度，直至計(jì)數(shù)為1000x109／L備用。(2)PRP的凍干處理預(yù)處理液的配制：采用NaCI、KCl、CaCl2Mg

2、S04、NaHC03、檸檬酸、檸檬酸鈉、乙酸鈉、葡萄糖、超純水、海藻糖及可逆性血小板激活抑制劑，調(diào)PH為6．6～6．8，0．22“m濾器過(guò)濾；凍干緩沖液的配制：血小板預(yù)處理液中加入總體積30％的同型血漿，調(diào)PH為6．6"-'6．8，0．22“rn濾器過(guò)濾后備用。血小板1500xg離心15min，棄去上清，保留下層血小板沉淀物，用與棄去上清相同體積的預(yù)處理液重懸血小板，37℃水浴振蕩4h，使血小板保持懸浮狀態(tài)。4h水浴后，將血小板懸液再以1500xg離心15min，棄去上清，保留下層血小板沉淀物，用與棄去上清相同體積的凍干緩沖液重懸血小板。將預(yù)處理后血小板懸液轉(zhuǎn)移到硅化玻璃瓶中，每瓶4ml，

3、置于．80"C超低溫冰箱中冷凍過(guò)夜，次日將凍于機(jī)打開(kāi)并使溫度降至．45"C后，再將樣品從．80。C超低溫冰箱取出，轉(zhuǎn)入凍干機(jī)進(jìn)行真空干燥，冷阱溫度為．45+5。C，真空度<133mbar，24h后取出，并將其密封后保存于室溫。(3)凍干血小板復(fù)水化檢測(cè)室溫下保存1d以上的樣品將其復(fù)水化，復(fù)水化液為貧血小板血漿III萬(wàn)方數(shù)據(jù)摘要(platelet。poorplasma，PPP)：無(wú)菌水=3：1(V／V)，加入4ml復(fù)水化液后的樣品，輕輕振蕩至完全溶解，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀分別測(cè)定凍干前及復(fù)水化后血小板計(jì)數(shù)和平均血小板體積(meanplateletvolume，MPV)，并計(jì)算血小板回收率與MPV凍

4、干前后差值：檢測(cè)血小板凍干前及凍干后dO、d10、d30生長(zhǎng)因子VEGF、TGF一13、PDGF-BB的釋放含量。2、SD大鼠深I(lǐng)I度燙傷模型的建立及FDP用于創(chuàng)面治療的效果研究將40只大鼠背部脫毛，脫毛面積4cm×6cm左右，用清水洗凈，觀察24h，確定脫毛部位皮膚無(wú)紅腫、炎癥和破損等異常情況。次日，SD大鼠禁食8h以上，用10％水合氯醛腹腔注射進(jìn)行麻醉，劑量為300mg／kg，麻醉生效后將大鼠固定于操作臺(tái)，75％酒精消毒備皮區(qū)域。將不銹鋼鍋盛水置于電磁爐上，并將509的砝碼置于鍋內(nèi)加熱至沸騰，持續(xù)5min。用止血鉗夾住砝碼上端立即置于大鼠脊柱兩側(cè)備皮區(qū)，稍加壓力，維持15s，即可形成半

5、徑為lcm的圓形深I(lǐng)I度燙傷創(chuàng)面；根據(jù)臨床燒傷處理常規(guī)，3h后行削痂術(shù)，直至創(chuàng)面由蒼白變?yōu)榧t潤(rùn)為止。將造模成功的40只大鼠隨機(jī)分成四組，再根據(jù)組別進(jìn)行上藥。FDP組：將每瓶?jī)龈裳“逵?mL同型血漿復(fù)溶，與葡萄糖酸鈣以10：1的比例混合進(jìn)行激活后，噴灑于無(wú)菌紗布上，制備成血小板凝膠紗布(1mL／倉(cāng)U面)，無(wú)菌紗布包扎；PI沖組：調(diào)整血小板濃度為1000×109／L，其他操作步驟同F(xiàn)DP組；燙傷膏組：無(wú)菌棉簽直接涂抹后，無(wú)菌紗布包扎；空白組：僅用無(wú)菌紗布浸濕生理鹽水包扎。換藥時(shí)間分別為d1、d3、d5、d7、d9、d13、d19，換藥同時(shí)用透明坐標(biāo)紙覆蓋創(chuàng)面，沿創(chuàng)緣畫(huà)膜，計(jì)算創(chuàng)面面積，并每組

6、隨機(jī)選取一個(gè)創(chuàng)面，取直徑約為lcm的創(chuàng)面組織用于組織學(xué)檢查(HE染色)。結(jié)果在血小板凍干效果評(píng)價(jià)中，凍干前后血小板數(shù)量和MPV存在著統(tǒng)計(jì)學(xué)的差異，細(xì)胞回收率為87．24％；生長(zhǎng)因子VEGF、TGF一13和PDGF—BB釋放量隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)并未有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異，但PDGF—BB的含量在凍干前后有所差異(P<0．05)。IV萬(wàn)方數(shù)據(jù)碩士學(xué)位論文在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，不同處理組對(duì)大鼠燙傷創(chuàng)面愈合率的影響結(jié)果表明，在治療過(guò)程中，燙傷創(chuàng)面結(jié)痂面積逐步減小，愈合率顯著上升。在治療的d7，PRP組與FDP組均使大鼠燙傷創(chuàng)面面積明顯縮小，具有明顯的促進(jìn)創(chuàng)面愈合作用，與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組差異有顯著性(P<0．05)，而

7、PI沖組FDP組之間無(wú)明顯差異。提示FDP具有與PRP相近的促進(jìn)燙傷創(chuàng)面早期愈合的作用。不同處理組對(duì)大鼠燙傷創(chuàng)面病理組織學(xué)的影響。100倍鏡下觀察d1的組織標(biāo)本：皮膚損傷至真皮深層，細(xì)胞水腫，變性壞死，正常結(jié)構(gòu)消失，呈空洞狀，膠原纖維斷裂，已符合深I(lǐng)I度燙傷的判定標(biāo)準(zhǔn)，提示造模成功；用藥d7：FDP組和PRP組表皮及真皮組織均有明顯的改善，皮膚創(chuàng)面的壞死組織及炎性滲出物顯著減少，毛細(xì)血管周?chē)性S多新生的成纖維細(xì)胞，可見(jiàn)大