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《3.MTT測定細(xì)胞增值抑制率》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、一、試驗原理MTT是一種粉末狀化學(xué)試劑，全稱為3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide，漢語化學(xué)名為3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名：噻唑藍(lán)。是一種黃顏色的染料。檢測原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶標(biāo)儀在490nm波長處測定其光吸收值，在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成
2、正比。根據(jù)測得的吸光度值（OD值），來判斷活細(xì)胞數(shù)量，OD值越大，細(xì)胞活性越強（如果是測藥物毒性，則表示藥物毒性越?。?。二、試驗準(zhǔn)備1.MTT的配置MTT一般最好現(xiàn)用現(xiàn)配，過濾后4℃?避光保存兩周內(nèi)有效，或配制成5mg/ml保存在-20℃長期保存，避免反復(fù)凍融。最好小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解?？砂袽TT粉末稱量分裝在EP管里，用的時候現(xiàn)配。當(dāng)MTT變?yōu)榛揖G色時就絕對不能再用了。配制MTT時用PBS（pH=7.4）溶解，60℃水浴助溶。MTT加入細(xì)胞前還是需要以過濾的方式滅菌為宜MTT有致癌性，MTT對細(xì)菌很敏感，配成
3、的MTT需要無菌。往96孔板加MTT時可以把操作臺及周圍上的照明燈關(guān)掉。MTT一般是過量的，所以96孔板中10uL足夠。培養(yǎng)基超過100uL，MTT按照10%的比例加入。MTT與培養(yǎng)基振蕩混勻。2.DMSO在同一實驗中不要更換DMSO，DMSO的量可為100uL或150uL。加DMSO前把孔中液體盡量棄干凈。否則一是沉淀會很難溶解，二培養(yǎng)液的顏色在檢測時也能被測到，會對最后結(jié)果造成影響。但前提是不能把細(xì)胞結(jié)晶沉淀也一起吸掉。加了DMSO后用振蕩器輕輕振蕩5-10min，時間控制盡量嚴(yán)格一點，放置時間長了會影響結(jié)果，值會偏大，且結(jié)果不可信。放入
4、37℃?放孵育箱15min溶解結(jié)晶。三、實驗操作1.收集對數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，每孔加入100uL鋪板使待測細(xì)胞調(diào)密度至1000-10000孔（邊緣孔用無菌PBS填充）。2.5%CO2，37℃孵育，至細(xì)胞單層鋪滿孔底（96孔平底板），加入濃度梯度的藥物。原則上，細(xì)胞貼壁后即可加藥，或兩小時，或半天時間，但我們常在前一天下午鋪板，次日上午加藥。一般5-7個梯度。每孔100uL，設(shè)3-5個復(fù)孔。建議設(shè)5個，否則難以反應(yīng)真實情況。3.5%CO2，37℃孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。4.每孔加入20uLMTT溶液（5mg/ml，即0.5
5、%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4h。若藥物與MTT能夠反應(yīng)，可先吸棄去培養(yǎng)液，小心用PBS潤洗2-3遍后，再加入含MTT的培養(yǎng)液。5.終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。6.每孔加入150uL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490nm/570nm處測量各孔的吸光值。7.同時設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜）。四、預(yù)實驗及注意事項正式試驗前，要進(jìn)行預(yù)實驗檢測其貼壁率、倍增時間以及接種不同細(xì)胞數(shù)條件下的生長曲線，確定試驗中每孔的接種細(xì)胞數(shù)和培養(yǎng)
6、時間，以保證培養(yǎng)終止致細(xì)胞過滿。保證MTT結(jié)晶形成數(shù)量與細(xì)胞數(shù)呈的線性關(guān)系。否則細(xì)胞數(shù)太多敏感性降低，太少觀察不到差異。1.藥物濃度的設(shè)定。一定要多看文獻(xiàn)，參考別人的結(jié)果再定個比較大的范圍先初篩。根據(jù)初篩的結(jié)果縮小濃度和時間范圍再細(xì)篩。否則，可能你用的時間和濃度根本不是藥物的有效濃度和時間。2.時間點的設(shè)定。在不同時間點的測定OD值，輸入excel表，最后得到不同時間點的抑制率變化情況，畫出變化的曲線，曲線什么時候變得平坦了（到了平臺期）那個時間點應(yīng)該就是最好的時間點（因為這個時候的細(xì)胞增殖抑制表現(xiàn)的最明顯）。3.培養(yǎng)時間。200ul的培養(yǎng)液
7、對于104～105增殖期細(xì)胞來說，很難維持68h，如果營養(yǎng)不夠的話，細(xì)胞會由增殖期漸漸趨向G0期而趨于靜止，影響結(jié)果，我們是在48h換液。4.MTT法只能測定細(xì)胞相對數(shù)和相對活力，不能測定細(xì)胞絕對數(shù)。做MTT時，盡量無菌操作，因為細(xì)菌也可以導(dǎo)致MTT比色OD值的升高。1.實驗時應(yīng)設(shè)置調(diào)零孔，對照孔，加藥孔。調(diào)零孔加培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜。對照孔和加藥孔都要加細(xì)胞、培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜，不同的是對照孔加溶解藥物的介質(zhì)，而加藥組加入不同濃度的藥物。2.避免血清干擾。用含15%胎牛血清培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞時，高的血清物質(zhì)會影響試驗孔的光吸收值。
8、由于試驗本底增加，會試驗敏感性。因此，一般選小于10%胎牛血清的培養(yǎng)液進(jìn)行。在呈色后，盡量吸凈培養(yǎng)孔內(nèi)殘余培養(yǎng)液。3.接種時最好按照預(yù)實驗摸索出的密度接種，因為細(xì)胞
