熒光定量PCR中探針法與染料法的區(qū)別

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1、熒光定量PCR中探針法與染料法的區(qū)別：　　一、熒光定量PCR中探針法與染料法的描述：　　1.熒光定量PCR探針法：探針法即除了引物外另外設置一個探針，在探針的兩端分別帶上發(fā)光集團和淬滅集團，這個時候，兩個平衡不發(fā)光，但是當DNA通過引物合成的時候，探針被折斷，釋放出發(fā)光集團和淬滅集團，兩個距離較遠，發(fā)光集團產(chǎn)生熒光，被機器收集到信號，從而檢測基因的量　　2、熒光定量PCRSYBRGreen染料法：染料能夠與雙鏈結合，當PCR擴增的時候，染料結合到DNA上，從而發(fā)光，單個的染料不發(fā)光，這樣就能收集到信號

2、，我們可以看出，染料法特異性不強，只要是雙鏈的DNA都回結合發(fā)光?！　《?、熒光定量PCR中探針法與染料法的優(yōu)缺點　　1、探針法通過探針可以增加反應收集信號的特異性，只有探針結合的片段上發(fā)生擴增才能收集到信號，能夠用多重體系反應的方法，能夠預測和提前進行反應條件的優(yōu)化，缺點是要合成探針，成本高　　2、染料法經(jīng)濟實惠，可以做溶解曲線，分析全部PCR產(chǎn)物的TM值，缺點就是特異性沒有探針法好【分享】定量pcr儀選則寶典:各自精彩的選擇　　如何選擇合適的定量PCR儀定量PCR儀主要由兩部分組成，一個是PCR系統(tǒng)

3、，一個是熒光檢測系統(tǒng)。選擇定量PCR儀的關鍵——由于定量PCR必需借助樣本和標準品之間的對比來實現(xiàn)定量的，對于定量PCR系統(tǒng)來說，重要的參數(shù)除了傳統(tǒng)PCR的溫控精確性、升降溫速度等等，更重要的還在于樣品孔之間的均一性，以避免微小的差別被指數(shù)級放大。至于熒光檢測系統(tǒng)，多色多通道檢測是當今的主流趨勢——儀器的激發(fā)通道越多，儀器適用的熒光素種類越多，儀器適用范圍就越寬;多通道指可同時檢測一個樣品中的多種熒光，儀器就可以同時檢測單管內多模版或者內標+樣品，通道越多，儀器適用范圍越寬、性能就更強大。熒光檢測系統(tǒng)

4、主要包括激發(fā)光源和檢測器。激發(fā)光源有鹵鎢燈光源、氬離子激光器、發(fā)光二極管LED光源，前者可配多色濾光鏡實現(xiàn)不同激發(fā)波長，而單色發(fā)光二極管LED價格低、能耗少、壽命長，不過因為是單色，需要不同的LED才能更好地實現(xiàn)不同激發(fā)波長。監(jiān)測系統(tǒng)有超低溫CCD成像系統(tǒng)和PMT光電倍增管，前者可以一次對多點成像，后者靈敏度高但一次只能掃描一個樣品，需要通過逐個掃描實現(xiàn)多樣品檢測，對于大量樣品來說需要較長的時間。定量PCR儀需要考慮的另外一個因素是軟件設計，這一點目前較新型號的儀器都有不錯的配套軟件可以滿足常規(guī)使用。

5、——隨著定量PCR技術在臨床診斷、疾病監(jiān)控、藥物監(jiān)測、腫瘤研究等領域的越來越廣泛的應用，市面上不同品牌和設計的定量PCR儀也不斷推陳出新，生物通在這里著重介紹不同的3類定量PCR儀，各有各精彩?！　?.傳統(tǒng)的96孔板式定量PCR儀傳統(tǒng)的96孔板式定量PCR儀以美國應用生物系統(tǒng)公司(ABI)為代表。傳統(tǒng)96孔板式定量PCR儀的優(yōu)點是可容納的樣本量大而且無需特殊耗材，可以采用傳統(tǒng)的96孔板甚至384孔板進行批量的定量反應，但是缺點也顯而易見——溫度均一性不佳——平板固定加熱模塊的PCR溫度控制有邊緣效應—

6、—樣品槽上每個孔之間的溫度存在差異——也就是所謂位置效應，因此標準曲線的反應條件應難以做到與樣本完全一致，樣本和樣本之間的溫度控制也可能存在差異，對于靈敏度極高的定量PCR來說，任何極微小的差異都會以指數(shù)級別的規(guī)模被放大，不能不說是一種缺憾。傳統(tǒng)反應板面積大，溫度控制的精確性、升降溫速度也相對較慢，因而反應速度也較慢。96孔板定量PCR儀的熒光檢測分析系統(tǒng)，由于96孔板上樣品孔的位置是固定的，每個樣品孔距離光源和監(jiān)測器的光程各不相同，有可能對結果產(chǎn)生影響。檢測在試管管底進行，試管底的透光性和厚薄均一性

7、都可能對結果產(chǎn)生影響。MJ和Bio-Red公司的定量PCR儀也屬于這一類。ABI的7500型熒光定量PCR儀激發(fā)光源為鹵鎢燈光源，5色濾光鏡，可同時激發(fā)96個樣品，超低溫CCD具備同時多點多色檢測的能力，能夠有效地分辨FAM/SYBRGreenI,VIC/JOE,NED/TAMRA/Cy3,ROX/TexasRed,和Cy5等熒光染料。多色熒光檢測技術為多重定量、SNP分析、基因型分型和帶陽性內對照的陰/陽性分析提供了基礎。多重定量即在同一反應管內同時對多個目標基因進行定量，可以大大提高精度并節(jié)約成本

8、。隨機配置的定量PCR引物和探針設計軟件PrimerExpress非常有用，“因為到目前為止還沒有其他軟件有能力設計定量PCR所需的TaqMan探針(生物通摘自ABI技術資料)”。各型號都有實時動態(tài)(Real-Time)和終點讀板(PlateRead)兩種運行模式。實時動態(tài)模式用于定量DNA或RNA拷貝數(shù)?？梢詣討B(tài)顯示PCR擴增曲線的生成，定量的線性范圍大于9個數(shù)量級，區(qū)分5000和10000個拷貝的DNA模板可信度達99.7%。終點讀板模式用于基因型鑒