薄層色譜（TCL）實驗

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1、薄層色譜（TCL）實驗一、實驗?zāi)康?、掌握薄層色譜操作技巧2、了解薄層色譜的基本原理和應(yīng)用二、實驗原理1、原理薄層色譜是一種微量分析的分離過程，它將樣品點在以玻璃板或鋁、塑料等片材為載體的多孔吸附劑薄層的固定相上，利用流動相在特定的展開室中將混合物中的組份推移到不同距離處，在色譜展開整個過程中，樣品的成份受到正反不同的力的作用。(1)流動相利用毛細(xì)管力帶著樣品穿過固定相。(2)樣品與固定相的相互作用是指組份在移行過程中由于偶極-（誘導(dǎo)）-偶極相互作用，氫鍵和范德華力的作用而產(chǎn)生不同程度的延緩、吸附、分散、離子交換和絡(luò)合等分離機理。由于樣品組份與流動相

2、和固定相之間的相互作用力程度不同，整個毛細(xì)管流動過程中分離運動都在進行?；谶@點，TLC系統(tǒng)（流動相和固定相）必須與樣品很好地匹配。用顯色試劑處理，許多組份可在日光或紫外燈光下檢視。色譜可用肉眼或使用光密度計和照相機記錄或影像系統(tǒng)方法來評價。2、薄層色譜的用途1）化合物的定性檢驗通過與已知標(biāo)準(zhǔn)物對比的方法進行未知物的鑒定。在條件一致的情況下，純化合物在薄層色譜中呈現(xiàn)一定的移動距離，稱比移值（Rf值）。利用薄層色譜法可鑒定化合物的純度或確定兩種性質(zhì)相似化合物是否為同一種物質(zhì)。影響比移值的因素很多，如薄層的厚度，吸附劑顆粒的大小，酸堿度、活性、外界溫度和

3、展開劑純度、組成、揮發(fā)度等。所以要獲得比移值重現(xiàn)性就比較困難。為此，在測定某一式樣時，最好用對照品和樣品同時對照進行。d2d12）快速分離少量物質(zhì)（幾到幾十ug，甚至0.01ug）3）跟蹤反應(yīng)進程，在進行化學(xué)反應(yīng)時，常利用薄層色譜觀察原料斑點的逐步消失，來判斷反應(yīng)是否完成。4）化合物純度的檢驗（只出現(xiàn)一個斑點，且無脫尾現(xiàn)象，為純物質(zhì)）3、主要操作步驟3薄層板的制備；薄層板的活化；薄層板色譜展開；薄層色譜顯色與分析。四、薄層色譜操作技巧1、手工自制板1.1玻璃板的要求：用于制備薄層板的玻璃板要求表面光潔、平整，最好使用厚薄1~2mm的優(yōu)質(zhì)平板玻璃，普通

4、窗玻璃一般不宜用于制作薄層板，玻璃板需洗凈至不掛水，晾干，貯存于干燥潔凈處備用。玻璃板反復(fù)使用時，應(yīng)注意經(jīng)常用洗液及堿液清洗，保持玻璃板面的光潔是保證薄層板質(zhì)量的最基本要求。1.2制作方法：除另有規(guī)定外，將1份吸附劑加適量的水（如1份硅膠G一般加3份水），在研缽中用研杵沿一個方向小心研磨至成均勻的有適當(dāng)粘稠度的膠漿，立即傾入涂布器中，均勻地向前推進涂布在玻璃板上，或按照不同涂布器的規(guī)定操作涂布，涂布好的薄層板于室溫下在水平臺上晾干，再在規(guī)定的溫度(一般為105℃~110℃)下活化約30分鐘，貯于干燥器中備用。薄層板的厚度一般為0.25~0.5mm.。

5、1.3商品化供應(yīng)的預(yù)制板和高效板板的尺寸一般有20×20cm，10×20cm，20×10cm，10×10cm2、TLC/HPTLC板的預(yù)洗及活化一般來說，色譜板應(yīng)用溶劑如氯仿-甲醇(8:2)，甚至用更強的洗脫溶劑的混合物進行預(yù)洗。具體操作可通過空白色譜展開來實現(xiàn)。色譜板預(yù)洗完后，應(yīng)在105°C加熱1小時進行干燥，再在室溫下置放至少2小時（需采取保護措施以防止實驗室空氣中的污染物重新附著在其上面，如放置在空的干燥器中）。3、樣品點樣3.1點狀點樣和條帶狀點樣每次點樣前，TLC/HPTLC板應(yīng)在正常光線下和紫外燈下用肉眼檢查薄層的損傷情況和雜質(zhì)，只有無損

6、傷、清潔的TLC/HPTLC板方可使用。樣品可進行點狀或條帶狀點樣。要想獲得最佳的薄層分辨率，必須保證移行方向中的起點要小，常規(guī)的TLC薄層點狀點樣每次點0.5至5微升。點樣量較大的樣品可使用自動化裝置點樣，噴霧成條帶狀是一種可以點樣量大而同時又能促成最有效分離的點樣方法。在常規(guī)操作過程中，人工點樣一般使用微量毛細(xì)管（0.5/1/2/3和5μl），點樣時毛細(xì)管必須完全充滿和完全排空，要以垂直方向小心接觸TLC/HPTLC板面，不要損傷薄層，受損的薄層會導(dǎo)致溶劑不規(guī)律地流動而在色譜上產(chǎn)生失真的TLC譜帶。3.2樣品點樣位置起點下緣的最小距離b取決于溶劑

7、量。兩個起點之間的距離c必須令平行移行的主成份不會相互觸及。點狀點樣時原點的直徑應(yīng)小于或等于3mm（高效板原點的直徑應(yīng)更?。?，條帶的長度d由點樣樣品體積或樣品的種類和相對于板的尺寸點樣的數(shù)目來決定。到板側(cè)邊的距離a必須足夠大以避免分離區(qū)失真變形。4、層析4.1展開室4.1.1直立式雙槽展開室具有節(jié)省溶劑、便于預(yù)平衡、可控制展開箱內(nèi)的濕度等優(yōu)點。4.1.2水平展開室可以從薄層板的兩側(cè)向中間水平地展開，這樣可使一塊薄層板所承受的樣品個數(shù)比常規(guī)上行展開的薄層板增加一倍。4.1.3自動展開室(AMD)可使用五種溶劑對同一薄層進行多次展開，自動控制預(yù)飽和、展開

8、方式、展開距離和干燥條件，分離效率比傳統(tǒng)方式提高三倍（可在80mm之內(nèi)分離40種成分），符合GLP/GMP要