資源描述:
《載體處理去磷酸化》由會(huì)員上傳分享,免費(fèi)在線閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫(kù)。
1、質(zhì)粒載體單酶切后的去磷酸化1、去磷酸化體系的確定:一般有兩種體系:20ul體系和50ul體系ddH2OXto20ulSAPbuffer2ulSAP1ul(一般0.05-2μg的DNA用1ul的SAP足夠)質(zhì)粒載體mul[m=(0.02nmol*質(zhì)粒大小kb*660)/質(zhì)粒濃度]2、反應(yīng)條件:37℃反應(yīng)30-60min65反應(yīng)15-30min(滅活SAP)用1XTE將去磷酸化后的載體補(bǔ)足300ul(為了下一步純化載體時(shí)減少損失)載體純化(個(gè)人不建議用膠回收柱純化,因?yàn)榧兓男屎艿停悄愕妮d體濃度很高或者你的柱子效率很高。建議使用酚氯
2、仿純化DNA的方法純化載體)加入酚:氯仿:異丙醇(25:24:1)300ul充分混勻10min左右8000rmp離心5min,分層后小心吸取上清于新離心管(千萬(wàn)不要吸到中間層,寧肯少吸點(diǎn)上清)加入300ul異丙醇于上清中,充分混勻8000rmp離心5min,小心倒去上清(一般載體純化是看不到底部沉淀,但并不表示沒(méi)有載體沉淀下來(lái))加入300ul70%乙醇洗滌沉淀8000rmp離心5min,小心倒去沉淀,室溫晾干5min,加20-50ul1XTE溶解載體。最后測(cè)濃度準(zhǔn)備下一步連接體系的建立以下為轉(zhuǎn)載前輩的去磷酸化方法,共大家參考:對(duì)單酶切
3、后的產(chǎn)物去磷酸化是指5‘端的磷酸基團(tuán),(3’端是-OH)。用CIAP去磷酸化,它能將5‘端突出的磷酸基團(tuán)消化掉,使質(zhì)粒載體自身不能形成閉合的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。單酶切的末端能夠發(fā)生載體自連。CalfIntestinalAlkalinePhosphatase,簡(jiǎn)稱(chēng)CIAP,中文名稱(chēng)為小牛腸堿性磷酸酶,是一種可以催化DNA、RNA、核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸水解釋放5′末端或3′末端磷酸基團(tuán)的酶。CalfIntestinalAlkalinePhosphatase也可以脫去蛋白質(zhì)絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸殘基上的磷酸基團(tuán)。經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切的質(zhì)粒5'端帶
4、有磷酸基團(tuán),在進(jìn)行基因克隆時(shí)為避免質(zhì)粒發(fā)生自連,可以使用CalfIntestinalAlkalinePhosphatase去除5'末端磷酸基團(tuán)。脫去5′末端磷酸基團(tuán)的質(zhì)粒不能發(fā)生自連。用途:去除DNA、RNA5′或3′末端的磷酸基團(tuán);通過(guò)去除載體或DNA片斷5′末端的磷酸基團(tuán),防止載體或DNA片斷自連;通過(guò)5′末端脫磷,為5′末端磷酸化放射性標(biāo)記準(zhǔn)備模板;用于蛋白質(zhì)絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸殘基的去磷酸化。來(lái)源:小牛腸粘膜。使用說(shuō)明:1.DNA5′末端的去磷酸化:a.參考如下表格設(shè)置去磷酸化反應(yīng):DNA0.05-2μgReactionBu
5、ffer(10X)2μl補(bǔ)充無(wú)核酸酶的去離子水至19μlCalfIntestinalAlkalinePhosphatase(1U/μl)1μlb.按上述體系配好之后,輕輕混勻(可以用移液器吹打混勻或用Vortex在最低速度輕輕混勻),隨后離心沉淀液體。c.37℃孵育30分鐘。d.后續(xù)可以使用酚氯仿抽提、乙醇沉淀等方法純化已脫磷酸化的DNA,也可以使用適當(dāng)?shù)腄NA純化試劑盒進(jìn)行純化。載體單酶切過(guò)夜,然后65度失活,直接加CIAP去磷酸化,再65度使之失活,不用酚仿抽提,直接做連接,行嗎?是不是必須做對(duì)照?----------------
6、----------------------------------------------------------------載體單酶切過(guò)夜,然后65度失活,直接加CIAP去磷酸化后,建議用酚、氯仿抽提或者用膠回收后做連接,因?yàn)镃IAP去磷酸化酶在螯合劑存在下,經(jīng)65度30分鐘加熱處理,99%的活性不可逆失活(根據(jù)反應(yīng)條件不同有時(shí)也有外),用膠回收可以除去酶蛋白。最好做個(gè)對(duì)照,檢驗(yàn)?zāi)愕娜チ姿峄欠癯晒Α?-----------------------------------------------------------------
7、--------------前些天才做完載體單酶切連接,現(xiàn)將自己的經(jīng)驗(yàn)介紹如下:1.載體單酶切三個(gè)小時(shí)足以,時(shí)間長(zhǎng)并不一定好。2.如果不需要連接效率的話,可以不用去磷酸化,但載體單酶切純化后最好馬上與你新制備的具相同粘末端的目的片段進(jìn)行連接反應(yīng),也就是說(shuō)一定要保持單酶切后的載體與目的片段的“新鮮”。3.載體和目的片段單酶切后建議直接用柱純化,我用的promega的柱,回收率很高。我的目的片段2KB,載體13KB。4.連接反應(yīng)目的片段與載體的摩爾比要高,最好10-20:1,因?yàn)閱蚊盖泻蟮妮d體與目的片段具有相同的粘末端容易出現(xiàn)自連,過(guò)量的
8、目的段可以促進(jìn)兩者的反應(yīng),有利于出現(xiàn)重組子。5.我的單酶切的載體沒(méi)有去磷酸化,單酶切目的片段也沒(méi)有磷酸化,4度24小時(shí)連接,挑24個(gè)單菌落有3個(gè)重組子??寺≈休d體的處理和去磷酸化克隆實(shí)驗(yàn)的成功與否,除了與連接方式以及載體