《親和純化技術》PPT課件

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1、親和色譜定義親和色譜是利用親和吸附作用分離純化生物物質的液相色譜法。親和色譜所用的固定相為鍵合親和配基的親和吸附介質（親和吸附劑）親和色譜原理親和色譜操作與一般的固定床吸附操作方式相似，多采用斷通式前端分析法，分為進料、雜質清洗、目標產物洗脫合層析柱再生四步。親和色譜原理料液進料（feedstockloading）含有目標產物的料液連續(xù)通入色譜柱，直至目標產物在色譜柱出口穿透雜質清洗(contaminantwashing)利用與溶解原料的溶液組成相同的緩沖液為清洗液，清洗色譜柱除去不被吸附的雜質；產物洗脫(targetproductelution)利用可使目

2、標產物與配基解離的溶液洗脫目標產物柱再生（columnregeneration)利用清洗液清洗再生色譜柱親和配基－酶、抗體和蛋白酶的抑制劑蛋白酶均存在抑制其活性的物質，稱為酶的抑制劑。它的分布很廣，有天然的生物大分子，如胰蛋白酶抑制劑（結合常數(shù)為109L/mol），也有小分子化合物如氨基芐脒（結合常數(shù)為4×104L/mol）?？贵w抗體和抗原之間具有高度特異性結合能力，結合常數(shù)在107~1012L/mol蛋白A（或稱A蛋白）A蛋白為分子量42kDa的蛋白質，存在于金黃色葡萄球菌的細胞壁中。它與動物免疫球蛋白G（IgG）具有很強的結合作用。親和配基－凝集素和色素

3、凝集素凝集素是與糖特異性結合的蛋白質的總稱。在這種蛋白質上具有糖的結合位點?？勺鳛槎嗵?、糖蛋白等含糖生物分子的配基。輔酶和磷酸酰苷各類脫氫酶和激酶需要在輔酶存在下表現(xiàn)出其生物催化活性。輔酶和脫氫酶之間有親和作用。三嗪類色素這類色素與NAD的結合部位相同，具有抑制酶活性的作用，能與脫氫酶、血清白蛋白、干擾素、核酸酶、溶菌酶等發(fā)生結合作用親和配基－過渡金屬等過渡金屬離子Cu2+等過渡金屬離子可與蛋白質表面的組氨酸的咪唑基發(fā)生親和結合作用。Cu2+等過渡金屬離子與N、O和S等供電原子產生配位鍵。組氨酸肝素肝素是存在于動物肝臟等器官中的酸性多糖類物質，分子量為5到3

4、0kDa，它與凝血蛋白質、脂蛋白等有親和作用。親和色譜-親和色譜介質應滿足條件具有親水性多孔結構，無非特異性吸附；物理和化學穩(wěn)定性高，有較高的機械強度含有可活化的反應基團粒徑均一的球形粒子介質的活化方法－溴化氰法溴化氰活化法用于親和色譜介質連接含有氨基的配基最初的溴化氰活化法，需要加入NaOH至pH為11，成功地將配基連接到軟性介質上。但是，溴化氰是劇毒試劑，并且具有揮發(fā)性。溴化氰活化介質后形成的氰氧基容易水解，而影響偶聯(lián)效率，活化后的介質帶有較強的電荷，導致非特異性吸附增加等。介質的活化方法－環(huán)氧基法環(huán)氧氯丙烷活化具有方便、快速、活化率高，毒性低的特點，是

5、目前廣泛采用的制備方法?；罨椒ǎ簩⒔橘|用水沖洗后，加入環(huán)氧氯丙烷和適當濃度的NaOH，然后振蕩反應2.5h左右。為了得到更高的活化效率，其中環(huán)氧氯丙烷和NaOH的用量，NaOH的濃度，反應時間都可以根據(jù)具體實驗做出調整。由于環(huán)氧氯丙烷為油相，而NaOH溶液為水相，為了促進兩者反應的進行，通常在混合物中加入助溶劑二甲基亞砜（DMSO）。親和色譜-間隔臂的作用當配基分子量較小時，為了排除空間位阻作用，需要在配基和載體之間連接一個“間隔臂”間隔臂的長度有一定限制，超過一定長度后，配基與目標分子的親和力會減弱親和色譜-影響親和吸附的因素雜質的影響料液中目標產物濃度

6、很低，雜質很多，少量雜質的非特異性吸附，會大大降低純化效果雜質的非特異性吸附量與其濃度、性質、載體材料、配基固定化方法等眾多因素相關料液流速流速的增大，分離速度加快，但柱效降低親和色譜-目標產物的特異性洗脫特異性洗脫利用含有與親和配基或目標產物具有親和結合作用的小分子化合物為洗脫劑，通過與親和配基或目標產物的競爭性結合，脫附目標產物。特異性洗脫條件溫和，有利于保護目標產物的生物活性。另外，由于僅特異性洗脫目標產物，對于特異性較低的親和體系或非特異性吸附較為嚴重的物系，特異性洗脫有利于提高目標產物的純度。親和色譜-目標產物的非特異性洗脫非特異性洗脫是提高洗脫液

7、的pH值、離子強度、離子種類或溫度等理化性質降低目標產物的親和吸附作用，是較多采用的洗脫方法。當親和結合力很大，利用通常的方法不能洗脫被吸附的目標產物時，可利用脲或鹽酸胍等變性溶液使目標產物發(fā)生結構變化，失去與配基的親和結合作用。但這些變性劑容易使目標產物或固定化配基發(fā)生失活或不可逆變性，需慎重使用。親和膜-定義親和膜是利用親和配基修飾的微濾膜為親和吸附介質親和純化目標蛋白質，是固定床親和層析的變型。親和膜-親和膜的提出固定床親和層析的缺陷以多糖凝膠為固定相，機械強度低，流速受限放大困難（放大采用徑向放大）親和膜思路提出“降低柱高、增大柱徑以降低壓降、提高流

8、速”親和膜-親和膜的原理親和配基固定在膜孔表面，流體