《實(shí)驗(yàn)三石蠟切片法》PPT課件

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1、實(shí)驗(yàn)三石蠟切片法一般光鏡技術(shù)組織細(xì)胞化學(xué)技術(shù)免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)放射自顯影技術(shù)電鏡技術(shù)組織培養(yǎng)技術(shù)組織學(xué)的研究方法涂片法鋪片法磨片法石蠟切片法火棉膠切片法冰凍切片法一般光鏡技術(shù)非切片法切片法本實(shí)驗(yàn)主要掌握一般光鏡技術(shù)中的切片法——石蠟切片技術(shù)。實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c基本要求：掌握石蠟切片的制片技術(shù)和基本原理。要求用HE染色方法染色，獲得清晰的組織切片。石蠟切片的流程1、取材2、固定3、組織塊修整4、洗滌5、脫水6、透明7、浸蠟與包埋8、切片與貼片9、脫蠟、復(fù)水（水化）10、染色11、脫水、透明12、封固1.取材動(dòng)物致死方

2、法：常用方法有麻醉法、空氣栓塞法、斷頭法、擊頭法、股動(dòng)脈放血法等；無(wú)尾兩棲類(lèi)常用探針破壞腦和脊髓的方法處死，鼠類(lèi)可用兩手（戴手套）用力拉，使顱骨和頸椎分離而導(dǎo)致延髓損傷致死。動(dòng)物保護(hù)組織材料新鮮動(dòng)作迅速取材注意事項(xiàng)：要熟悉取材部位；所取材料盡可能新鮮；組織塊力求小而?。汉穸纫话悴怀^(guò)5mm為宜，較理想的厚度為2mm左右；勿使組織塊受擠壓，以免破壞組織；保持材料清潔，以免影響觀察。2.固定固定：固定是指處死的動(dòng)物體或新取的組織塊投入固定液使其結(jié)構(gòu)得以凝固為不溶性物質(zhì)的過(guò)程。其目的在于保持組織內(nèi)細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)

3、構(gòu)及其組成，防止細(xì)胞組織死后的自溶和腐敗，使之盡量保持生前的狀態(tài)和結(jié)構(gòu)。注射、灌注固定法小塊組織固定法常用的固定液有：甲醛（福爾馬林）、酒精、醋酸、苦味酸、鋨酸、Bouin's液等。固定液的用量通常為材料塊的20倍左右；固定時(shí)間則根據(jù)材料塊的大小及松密程度以及固定液的穿透速度而定，可以從1小時(shí)至數(shù)天，通常為數(shù)小時(shí)至24小時(shí)。常用的固定方法3.組織塊修整組織塊修整：經(jīng)過(guò)固定后的組織有一定的硬度，此時(shí)就可以做一些修整，但改變不要太大，只要將組織材料切取平整，修掉一些不規(guī)則的部位；過(guò)大、過(guò)厚的組織改小、改薄。4

4、.洗滌洗滌：將殘余在組織內(nèi)的固定液清洗干凈，以免影響對(duì)組織內(nèi)部結(jié)構(gòu)的觀察、分析、研究。常用的洗滌方法水洗法（含有鉻、鋨的固定液固定的組織塊）酒精洗滌法（含有苦味酸、酒精固定液固定的組織塊）5.脫水脫水：將組織塊內(nèi)的水份被置換出的過(guò)程叫脫水；脫水目的是使水分完全除去的同時(shí)使組織塊變硬。現(xiàn)采用的脫水劑一般是乙醇或丙酮來(lái)進(jìn)行梯度脫水；脫水的時(shí)間，可根據(jù)組織的類(lèi)型，大小而定。方法：70%→80%→95%(ⅰ)→95%(ⅱ)→無(wú)水酒精（?。?-2h1-2h1-2h1-2h30min-1h無(wú)水酒精（ⅱ）30min-

5、1h脫水注意事項(xiàng)：原則是在脫水徹底的前提下，盡量縮短脫水的時(shí)間；脫水應(yīng)逐步而不應(yīng)跨越太大進(jìn)行；如需要可在70%的酒精中過(guò)夜或長(zhǎng)期保存；如系胚胎或柔軟組織脫水，應(yīng)從更低濃度的酒精開(kāi)始；每級(jí)脫水移入高濃度以前，應(yīng)用吸水紙吸凈表面的殘液。6.透明（媒浸）透明（媒浸）：無(wú)水酒精不能與石蠟相溶，還需用能與酒精和石蠟相溶的媒浸液，替換出組織內(nèi)的酒精。材料塊在這類(lèi)媒浸液中浸漬，出現(xiàn)透明狀態(tài)，此液即稱(chēng)透明劑，透明劑浸漬過(guò)程稱(chēng)透明。常用的透明劑有二甲苯、苯；透明劑的浸漬時(shí)間則要根據(jù)組織材料塊大小和性質(zhì)而定。方法:純酒精:二

6、甲苯（1:1)→二甲苯(ⅰ)→二甲苯（ⅱ）15min-30min15min-30min15min-30min7.浸蠟與包埋浸蠟：是將已透明的組織塊移入熔化的石蠟內(nèi)浸沒(méi)的過(guò)程。目的是用石蠟取代透明劑，使石蠟浸入組織而起支持作用。通常浸蠟應(yīng)在高于石蠟熔點(diǎn)3℃左右的溫箱中進(jìn)行，以利石蠟浸入組織內(nèi)。方法：浸蠟（ⅰ）→浸蠟（ⅱ）→浸蠟（ⅲ）30min-1h1-2h1-2h包埋：將浸蠟后的組織塊包在石蠟之中，并使組織塊與石蠟一起凝固成均勻一致的蠟塊的過(guò)程叫包埋。方法：將紙盒盛滿(mǎn)已融化的石蠟，隨即將第三杯中已浸蠟的材料

7、放入其中，并排出里面的氣泡待石蠟表面凝結(jié)后，將紙盒進(jìn)入水中冷卻石蠟全部凝結(jié)后，拆去紙盒即成蠟塊。組織在蠟塊中可以長(zhǎng)期保存。8.切片與貼片切片：1)修塊：切去組織標(biāo)本周?chē)^(guò)多的石蠟，不能留的過(guò)少，否則容易造成組織破壞。一般情況下在組織周?chē)鷳?yīng)留約1-2mm的石蠟邊，把蠟塊修成上下兩對(duì)邊平行的方形或梯形，否則會(huì)造成石蠟切出的蠟帶不整齊或歪向一邊。2)固著：將修好的蠟塊用蠟粘在大小適宜的小木塊上，木塊裝在切片機(jī)上，以待切片。3)切片：在旋轉(zhuǎn)式切片機(jī)上將蠟塊切成5-10um厚的薄片。切下的薄片會(huì)連成蠟帶。用毛筆輕托

8、輕取蠟帶，放在蠟帶盒內(nèi)備用。切片修塊18貼片：（粘片、表片、展片）是將已切成的蠟帶分割成小段后粘貼于載玻片的過(guò)程。用粘片劑將展平的蠟片牢附于載玻片上，以免在以后操作中材料脫落。在載玻片上涂抹粘片劑，再滴蒸餾水，放上蠟帶，置于調(diào)好溫度的水浴鍋上鋪展。將載玻片放入45℃溫箱中干燥。9.脫蠟及復(fù)水脫蠟：用二甲苯將組織中的石蠟溶解掉，石蠟將會(huì)妨礙染料進(jìn)入組織、細(xì)胞中而不易染色。復(fù)水：從第二杯二甲苯取出的切片經(jīng)100%→95%→80%→