實(shí)驗(yàn)四總氮量的測定--凱氏定氮法

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1、實(shí)驗(yàn)四總氮量的測定——?jiǎng)P氏定氮法目的和要求1.學(xué)習(xí)凱氏定氮法的原理。2.掌握微量凱氏定氮法的操作技術(shù)，包括標(biāo)準(zhǔn)梳酸銨含氮量的測定、未知樣品的消化蒸餾、滴定及其含氮量的計(jì)算等。實(shí)驗(yàn)原理天然有機(jī)物（如蛋白質(zhì)、核酸及氨其酸等）的含氮量用凱氏定氮法來測定。當(dāng)天然含氮有機(jī)物與濃硫酸共熱時(shí)，分解出氮、二氧化碳及水。氮轉(zhuǎn)變出的氨與硫酸化合生成硫酸銨。分解反應(yīng)進(jìn)行得很慢，可加入硫酸銅及硫酸鉀或硫酸鈉促進(jìn)之，其中硫酸銅為催化劑，硫酸鉀或硫酸鈉可提高消化液的沸點(diǎn)。氧化劑過氧化氫也能加速反應(yīng)。消化完了后，在凱氏定氮儀中加入強(qiáng)堿堿化消化液，使硫酸銨分解，放出氨。用水蒸汽蒸

2、餾法，將氨蒸入過量標(biāo)準(zhǔn)無機(jī)酸溶液中，然后用標(biāo)準(zhǔn)堿溶液進(jìn)行滴定，準(zhǔn)確測定氨量，從而折算出含氮量。以甘氨酸為例，該過程的化學(xué)反應(yīng)如下：測定時(shí)常用硼酸溶液收集氨，氨與溶液中的氫離子結(jié)全，生成銨離子，使溶液中氫離子濃離降低。然后再用強(qiáng)酸滴定，直至恢復(fù)溶液中原來氫離子濃度為止。所用的強(qiáng)酸的當(dāng)量數(shù)即相當(dāng)于被測樣品中氨的當(dāng)量數(shù)。本法適用的范圍為0.2-1.0mg氮。相對誤差應(yīng)小于±2%。試劑①濃硫酸②硫酸銅③硫酸鉀④氫氧化鈉溶液：400g/L⑤硼酸吸收液：40g/L，稱取20g硼酸溶解于500mL熱水中，搖勻備用。⑥HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液：0.1000mol/L。⑦甲基

3、紅-溴甲酚綠混合指示劑：5份2g/L溴甲酚綠95%乙醇溶液與1份2g/L甲基紅乙醇溶液混合均勻。主要儀器：如圖，凱氏定氮蒸餾裝置。50mL消化管50mL容量瓶分析天平電爐小玻璃珠3mL微量滴定管烘箱1000mL蒸餾燒瓶遠(yuǎn)紅外消煮爐實(shí)驗(yàn)流程樣品消化蒸餾吸收滴定實(shí)驗(yàn)流程樣品消化準(zhǔn)確稱取0.1g左右的干燥面粉作為本實(shí)驗(yàn)的樣品。準(zhǔn)備4個(gè)50ml的凱氏燒瓶，并標(biāo)號，向第1、2號燒瓶內(nèi)各加入樣品0.1g，催化劑（K2SO4-CuSO4·5H2O）200mg，消化液5mL。注意加樣品時(shí)應(yīng)直接送入燒瓶底部，切勿沾于瓶口及瓶頸上。向3、4號燒瓶加入0.1ml蒸餾水和

4、與1及2號瓶相同的催化劑和濃硫酸，作為空白對照，測量試劑中可能含有的微量含氮物質(zhì)，以對樣品進(jìn)行校正。小心搖勻后，按圖安裝消化裝置，置于電爐上，在通風(fēng)櫥內(nèi)加熱消化。消化時(shí)先以小火緩慢加熱，待內(nèi)容物完全炭化、泡沫消失后，加大火力保持瓶內(nèi)液體微沸，消化至溶液呈藍(lán)綠色透明后，再繼續(xù)加熱微沸0.5h，取下冷卻，小心加入20mL水，移入100mL容量瓶中，用少量水洗定氮瓶，并入容量瓶中，再加水至刻度，混勻備用。同時(shí)做試劑空白試驗(yàn)。蒸餾、吸收取2～3個(gè)50ml的維形瓶，加入5ml左右2%硼酸-指示劑混合液，用表面皿覆蓋備用。準(zhǔn)確吸取10mL樣品處理液由小漏斗流入

5、反應(yīng)室，并以10mL水洗滌小燒杯使之流入反應(yīng)室內(nèi)，塞緊玻璃塞。從安全漏斗中慢慢加入10mL400g/L氫氧化鈉，溶液應(yīng)呈藍(lán)褐色。不要搖動，將定氮球連接好。用直火加熱蒸餾30min，將蒸餾裝置出口離開液面繼續(xù)蒸餾1min，用蒸餾水淋洗尖端后停止蒸餾。待樣品和空白消化液均蒸餾完畢后，同時(shí)進(jìn)行滴定。滴定全部蒸餾完畢后，用0.0100N標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液滴定各錐形瓶中收集的氨量，直至硼酸-指示劑混合液由綠色變回淡紫色，即為滴定終點(diǎn)。結(jié)果計(jì)算若測定的樣品含氮部分是蛋白質(zhì)，則有式中：A為滴定樣品用去鹽酸平均毫升數(shù)：B為滴定空白用去鹽酸平均毫升數(shù)；C為稱量樣品的克數(shù)；

6、0.0100為鹽酸的當(dāng)量濃度（實(shí)際上，此項(xiàng)應(yīng)按實(shí)驗(yàn)中使用鹽酸的實(shí)際濃度填寫）；14為氮的原子量；6.25為系數(shù)（1ml0.01N鹽酸相當(dāng)于0.14mg氮）。若樣品中除有蛋白質(zhì)外，尚有其他含氮物質(zhì)，則樣品蛋白質(zhì)含量的測定要復(fù)雜一些。首先，需向樣品中加氯乙酸，使其最終濃度為5%，然后測驗(yàn)定未加三氯乙酸的樣品及加入三氯乙酸后樣品的上清液中的含量氮量，得出非蛋白氮量及總氮量，從而計(jì)算出蛋白氮，再進(jìn)一步折算出蛋白質(zhì)含量。蛋白氮=總氮-非蛋白氮蛋白質(zhì)含量（克/%）=蛋白氮×6.25注意：蒸餾時(shí)實(shí)驗(yàn)室中切忌有堿性霧氣（如氨），否則將嚴(yán)重地影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確度。若

7、反應(yīng)室內(nèi)液體太多，超過1/2，又不易排出時(shí)，只能拆開儀器倒出貯液。但是一般盡量避免發(fā)生此種情況。折卸時(shí)應(yīng)特別小心，防止損壞儀器。拆卸儀器應(yīng)首先放松用來固定冷凝管的萬能夾，然后小心地將冷凝管向下錯(cuò)開，待反應(yīng)室外殼與冷凝管分開后，再移動反應(yīng)室。“空白”滴定值包括水及氫氧化鈉溶液中含有的微量的氨。因些，水質(zhì)對“空白”滴定值的影響甚大?！跋瘶悠贰弊詈笥谩跋瞻住边M(jìn)行校正計(jì)算，“不消化的樣品”最后用“不消化的空白”進(jìn)行校正計(jì)算。而且，在實(shí)驗(yàn)中，稀釋樣品的水與“空白”的水應(yīng)當(dāng)取自于同一瓶中。蛋白質(zhì)是一類復(fù)雜的含氮化合物，其中每一種蛋白質(zhì)都有恒定的含氮量，一

8、般大約為14-18%，平均為16%。由凱氏定氮法測出含氮量，再乘以系數(shù)6.25（即每含氮1g，就表示該物質(zhì)含蛋白質(zhì)6.25