實(shí)驗(yàn)四細(xì)菌質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移

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1、實(shí)驗(yàn)四細(xì)菌質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移李曉華程國軍一:目的要求了解在自然條件下微生物遺傳信息傳遞的方式;掌握細(xì)菌質(zhì)粒轉(zhuǎn)移的原理和流程。二:基本原理在質(zhì)粒轉(zhuǎn)移過程中,供體菌與受體菌細(xì)胞通過結(jié)合作用緊密接觸,質(zhì)粒從供體細(xì)胞向受體轉(zhuǎn)移,同時(shí)進(jìn)行質(zhì)粒復(fù)制,這就是結(jié)合轉(zhuǎn)移的過程。按能否自主轉(zhuǎn)移,將天然存在的質(zhì)粒分為兩大類。1.轉(zhuǎn)移型質(zhì)粒:多為低拷貝的大質(zhì)粒,含有完整的轉(zhuǎn)移操縱子基因(tra)和轉(zhuǎn)移起始位點(diǎn)。能在同種或親緣關(guān)系近的菌體細(xì)胞間進(jìn)行轉(zhuǎn)移。例如:大腸桿菌:F因子、R1、R100、R6K、RP4……天藍(lán)色鏈霉菌:致育

2、性因子pSCP1、pSCP2……2.非轉(zhuǎn)移型質(zhì)粒:多為高拷貝的小質(zhì)粒,如大腸桿菌的ColE1、RSF1010等。由于缺少轉(zhuǎn)移基因(tra),不能自主轉(zhuǎn)移,但由于含有與F質(zhì)粒類似的bom(或nic)位點(diǎn)或誘動(dòng)基因mob(mobilization),因而能被帶有tra基因的轉(zhuǎn)移性質(zhì)粒誘動(dòng)而發(fā)生轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移子的篩選篩選培養(yǎng)基為:基本培養(yǎng)基+抗生素;供體和輔助大腸桿菌均營養(yǎng)缺陷型,不能在基本培養(yǎng)基上生長;未轉(zhuǎn)化成功的受體菌不能在有抗生素的平板上生長。三:實(shí)驗(yàn)菌株供體菌:E.coliDH5α(pTR102)(T

3、cR),含有mob基因;受體菌:紫云英根瘤菌(TcS);輔助菌:E.coliMM294(pPK2073)(SpeR),含有tra基因。四:實(shí)驗(yàn)內(nèi)容準(zhǔn)備將受體、供體、輔助菌分別培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期:供體菌:E.coliDH5α(pTR102)(TcR),LB+Tc20μg/ml,37℃震蕩培養(yǎng)1夜;受體菌:Sinorhizobiumfredii(TcS),TY,28℃震蕩培養(yǎng)2天;輔助菌:E.coliMM294(pPK2073)(SpeR),LB+Spe50μg/ml37℃震蕩培養(yǎng)1夜用可調(diào)定量移液器吸取供體

4、、輔助菌各0.4ml,吸受體菌0.6ml,都加入同一eppdorf管內(nèi)(每個(gè)同學(xué)做1管),放入離心機(jī)內(nèi),10000轉(zhuǎn)/min離心1分鐘。倒上清,向沉淀加1ml的TY液體,用tip上下抽吸,洗滌菌體,再10000轉(zhuǎn)/min離心1分鐘,倒上清,留100μl左右用于懸浮菌體。倒TY平板,然后用鑷子取滅菌濾紙片貼于已準(zhǔn)備好的TY平板上(每2個(gè)同學(xué)1片,2-3片/平板)。用200μl的tip抽吸eppdorf管內(nèi)沉淀的菌體,打散成濃菌液,將之加到濾紙片中央(切勿傾斜平板,以免菌液流出濾紙片以外),吹干。28℃

5、培養(yǎng)2天。操作步驟(第一天)倒SM平板將基本培養(yǎng)基(SM)溶化,加千分之一的維生素混合液,然后加相應(yīng)量的四環(huán)素(15U/ml),每2人1皿。另準(zhǔn)備1瓶基本培養(yǎng)基,不加抗生素,用于對(duì)照。將倒好的平板用報(bào)紙包好后放入4℃冰箱,備用。(注:四環(huán)素在強(qiáng)光下易分解)向滅菌青霉素瓶中加3ml無菌水,將已培養(yǎng)的TY平板上的濾紙片用無菌鑷子放入水中,在震蕩混勻器上洗菌體,充分打散。向1ml的ep管加0.9mL無菌水,取0.1ml菌液,混勻。吸取200μL涂皿。少數(shù)同學(xué)另取稀釋液,涂1板不加Tc的SM做對(duì)照。平板放2

6、8℃培養(yǎng)4-6天后看結(jié)果。操作步驟(第三天)五:實(shí)驗(yàn)報(bào)告內(nèi)容轉(zhuǎn)移頻率=SM+Tc平板的單菌落數(shù)/純SM平板的單菌落數(shù)SM+Tc平板的單菌落數(shù)為:純SM平板的單菌落數(shù)為:六:思考題你認(rèn)為本次實(shí)驗(yàn)方法適合哪些方面的研究工作?

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