實(shí)驗(yàn)四血凝及血凝抑制實(shí)驗(yàn)

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1、實(shí)驗(yàn)四血凝及血凝抑制實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.了解血凝及血凝抑制實(shí)驗(yàn)原理2.掌握血凝及血凝抑制試驗(yàn)方法3.掌握基本操作技術(shù),了解其實(shí)用價(jià)值實(shí)驗(yàn)原理凝集試驗(yàn)：顆粒性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合后發(fā)生凝集的血清學(xué)試驗(yàn)?？乖c抗體復(fù)合物在電解質(zhì)作用下，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間，形成肉眼可見(jiàn)的凝集團(tuán)塊。試驗(yàn)可在玻板上進(jìn)行，稱(chēng)為玻板凝集試驗(yàn)，可用已知抗原檢查未知抗體，或用于已知抗體診斷未知抗原，；亦可在試管中進(jìn)行，稱(chēng)試管凝集試驗(yàn)，主要用于抗血清效價(jià)測(cè)定。實(shí)驗(yàn)原理某些病毒具有凝聚某些動(dòng)物紅細(xì)胞的能力，稱(chēng)為病毒的血凝，利用這種特性設(shè)計(jì)的試驗(yàn)稱(chēng)為血球凝集試驗(yàn)，以此來(lái)推測(cè)被檢材料中有無(wú)病毒存在，是非特異性

2、的，但是病毒的血凝可為相應(yīng)的特異性抗體所抑制，即血球凝集抑制實(shí)驗(yàn)，具有特異性，通過(guò)HA-HI實(shí)驗(yàn)，可用已知的血清來(lái)鑒定未知的病毒血凝試驗(yàn)原理血凝素（hemagglutininHA）：（HA，從H1—H15),呈柱狀由病毒基因編碼的糖蛋白刺突。功能：①吸附細(xì)胞：與細(xì)胞上受體結(jié)合,使病毒侵入細(xì)胞②凝集多種動(dòng)物的紅細(xì)胞（血凝試驗(yàn)）：HA能與人或其它動(dòng)物多種紅細(xì)胞表面N－乙酰神經(jīng)氨酸酶受體結(jié)合引起紅細(xì)胞凝集③具抗原性：其抗體能中和病毒---中和抗體：抑制血凝（血凝抑制試驗(yàn)）血凝素（HA）柱狀流感病毒結(jié)構(gòu)模式圖血凝原理血凝抑制原理血凝抑制試驗(yàn)原理病毒引起的血凝現(xiàn)象能

3、被相應(yīng)的抗血凝素抗體所抑制，即抗體與病毒結(jié)合后，血凝素?zé)o法吸附于紅細(xì)胞表面的受體上，用免疫血清阻止紅細(xì)胞凝集的現(xiàn)象，稱(chēng)為血凝抑制．實(shí)驗(yàn)材料器材：U型或V型微量反應(yīng)板、微量移液器、槍頭試劑：1%雞紅細(xì)胞、NDIV血凝素、NDIV抗血清、生理鹽水實(shí)驗(yàn)步驟1.取96孔V型反應(yīng)板1塊置于水平實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，在第1排1-10孔內(nèi)加入25ul生理鹽水，第11孔不加。第12孔加25ul生理鹽水2.在第1孔內(nèi)加入血凝素25ul，混勻后吸出25ul加入第2孔內(nèi)，再混勻后吸出25ul加入第3孔內(nèi)，依次類(lèi)推至第10孔時(shí)棄掉25ul。第12孔不加作陰性對(duì)照孔。3.在1-12孔均加入25

4、ul的生理鹽水。4.在每孔內(nèi)加入25ul1%的雞紅細(xì)胞懸液，震蕩，室溫靜止感作15-30min，每5min觀(guān)察一次結(jié)果。5.計(jì)算血凝效價(jià)，稀釋使成為四價(jià)備用．以出現(xiàn)十十血凝的血凝素最高稀釋度為其血凝效價(jià)，即為1個(gè)血凝單位，實(shí)驗(yàn)時(shí)采用4個(gè)血凝素單位，例如血凝素效價(jià)為1∶320，為1個(gè)單位，4個(gè)單位即為1∶80稀釋。下面前經(jīng)校對(duì)取4個(gè)血凝單位用于實(shí)驗(yàn)血凝試驗(yàn)結(jié)果判定效價(jià)判定：凝集特別顯著：“＋＋＋＋”凝集現(xiàn)象次之：“＋＋＋”凝集清楚可見(jiàn)：“＋＋”稍顯凝集者：“＋”血凝效價(jià)：呈“＋＋”凝集時(shí)的最高稀釋度。此時(shí)的稀釋度即為1個(gè)血凝單位。結(jié)果判定1.在各組對(duì)照均正確

5、的情況下，按下列標(biāo)準(zhǔn)判定血凝反應(yīng)強(qiáng)度示意圖“4＋”紅細(xì)胞呈片狀凝集，均勻布滿(mǎn)孔底，邊緣有時(shí)不整齊或皺縮。“3＋”紅細(xì)胞呈片狀凝集，但面積略小于“4+”?！?＋”紅細(xì)胞呈片狀凝集，但有少許沉積孔底中部呈小圓點(diǎn)狀?！埃奔t細(xì)胞大部分沉于孔底中央，周?chē)猩倭可⒃谀w粒?！埃奔t細(xì)胞均沉于孔底呈小圓點(diǎn)狀，邊緣整齊。2.對(duì)照孔正常的情況下，紅細(xì)胞凝集100%的稀釋度為判定血凝價(jià)的終點(diǎn)。凡能使雞紅細(xì)胞完全凝集的病毒最高稀釋倍數(shù)為病毒的凝集價(jià)。血凝抑制1.取96孔V型反應(yīng)板1塊置于水平實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，在第1排1-10孔內(nèi)加入25ul生理鹽水，第11孔不加。第12孔加25ul

6、生理鹽水。2.在第1孔內(nèi)加入被檢血清25ul，混勻后吸出25ul加入第2孔內(nèi)，再混勻后吸出25ul加入第3孔內(nèi)，依次類(lèi)推至第10孔時(shí)棄掉25ul。第12孔不加作陰性對(duì)照孔。3.在1-12孔內(nèi)均加入“四價(jià)”血凝素25ul，震蕩后，室溫靜止作用5min。4.在1-12孔內(nèi)均加入1%的雞紅細(xì)胞懸液25ul，震蕩，室溫感作15-30min，每5min觀(guān)察一次結(jié)果。5.觀(guān)測(cè)結(jié)果，記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)．血凝抑制試驗(yàn)結(jié)果判定測(cè)定孔R(shí)BC沉于孔底中心，呈紐扣狀。(+)凝集（-）病毒對(duì)照孔：凝集RBC對(duì)照孔：無(wú)自凝血凝抑制試驗(yàn)效價(jià)：呈完全血凝抑制的最高血清稀釋度。思考問(wèn)題1.計(jì)算出

7、病毒的凝集價(jià)、血凝抑制價(jià)2.血凝試驗(yàn)中為什么要加補(bǔ)充液？3.為什么加病毒液和紅細(xì)胞懸液時(shí)要反向加？4.病毒凝集紅細(xì)胞是不是一種特異的抗原體反應(yīng)?血凝抑制實(shí)驗(yàn)是不是特異的抗原抗體反應(yīng)?為什么?孔號(hào)1234567891011(+)12（-)HA稀釋度248163264128256、、、、棄生理鹽25252525252525252525x25血凝素2525252525252525252525血凝素x生理鹽水2525252525252525252525251%雞紅細(xì)胞252525252525252525252525結(jié)果預(yù)測(cè)+++++++++++++++++++++

8、+++++--++++_孔號(hào)1234567891011(+)12（