細(xì)胞凋亡檢測(cè),細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)步驟,檢測(cè)方法

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1、細(xì)胞凋亡檢測(cè)，細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)步驟，檢測(cè)方法一、?定性和定量研究只定性的研究方法：常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳、脈沖場(chǎng)倒轉(zhuǎn)瓊脂糖凝膠電泳、形態(tài)學(xué)觀察（普通光學(xué)顯微鏡、透射電鏡、熒光顯微鏡）進(jìn)行定量或半定量的研究方法：各種流式細(xì)胞儀方法、原位末端標(biāo)記法、ELISA定量瓊脂糖凝膠電泳。二、區(qū)分凋亡和壞死可將二者區(qū)分開的方法：瓊脂糖凝膠電泳，形態(tài)學(xué)觀察（透射電鏡是是區(qū)分凋亡和壞死最可靠的方法），Hoechst33342/PI雙染色法流式細(xì)胞儀檢測(cè)，AnnexinV/PI雙染色法流式細(xì)胞儀檢測(cè)等。不能將二者區(qū)分開的方法：原位末端標(biāo)

2、記法、PI單染色法流式細(xì)胞儀檢測(cè)等。三、樣品來(lái)源不同選擇組織：主要用形態(tài)學(xué)方法(HE染色，透射電鏡、石蠟包埋組織切片進(jìn)行原位末端標(biāo)記，ELISA或?qū)⒔M織碾碎消化做瓊脂糖凝膠電泳)。四、細(xì)胞凋亡檢測(cè)1、?早期檢測(cè):1)PS(磷脂酰絲氨酸)在細(xì)胞外膜上的檢測(cè)2)細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)改變的檢測(cè)3)細(xì)胞色素C的定位檢測(cè)4)線粒體膜電位變化的檢測(cè)2、?晚期檢測(cè)：細(xì)胞凋亡晚期中，核酸內(nèi)切酶在核小體之間剪切核DNA，產(chǎn)生大量長(zhǎng)度在180-200bp的DNA片段。對(duì)于晚期檢測(cè)通常有以下方法：1)TUNEL(末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶

3、介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記)2)LM-PCRLadder(連接介導(dǎo)的PCR檢測(cè))3)TelemeraseDetection(端粒酶檢測(cè))3、生化檢測(cè)：1）典型的生化特征：DNA片段化2）檢測(cè)方法主要有：瓊脂糖凝膠電泳、原位末端標(biāo)記（TUNEL）等3）TUNEL（末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記）4）通過DNA末端轉(zhuǎn)移酶將帶標(biāo)記的dNTP（多為dUTP）間接或直接接到DNA片段的3’-OH端，再通過酶聯(lián)顯色或熒光檢測(cè)定量分析結(jié)果?？勺黾?xì)胞懸液、福爾馬林固定或石蠟處理的組織、細(xì)胞培養(yǎng)物等多種樣本的檢

4、測(cè)。4、LM-PCRLadder(連接介導(dǎo)的PCR檢測(cè))當(dāng)?shù)蛲黾?xì)胞比例較小以及檢測(cè)樣品量很少（如活體組織切片）時(shí)，直接瓊脂糖電泳可能觀察不到核DNA的變化。通過LM-PCR,連上特異性接頭，專一性地?cái)U(kuò)增梯度片段，從而靈敏地檢測(cè)凋亡時(shí)產(chǎn)生梯度片段。此外，LM-PCR檢測(cè)是半定量的，因此相同凋亡程度的不同樣品可進(jìn)行比較。如果細(xì)胞量很少，還可在分離提純DNA后，用32P-ATP和脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）使DNA標(biāo)記，然后進(jìn)行電泳和放射自顯影，觀察凋亡細(xì)胞中DNAladder的形成。上述兩種方法都針對(duì)細(xì)胞凋

5、亡晚期核DNA斷裂這一特征，但細(xì)胞受到其它損傷（如機(jī)械損傷，紫外線等）也會(huì)產(chǎn)生這一現(xiàn)象，因此它對(duì)細(xì)胞凋亡的檢測(cè)會(huì)受到其它原因的干擾。需結(jié)合其它的方法來(lái)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。其它方法：1）TelemeraseDetection(端粒酶檢測(cè))端粒酶是由RNA和蛋白組成，它可以自身RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成端粒區(qū)重復(fù)序列，使細(xì)胞獲得“永生化”。正常體細(xì)胞是沒有端粒酶活性的，每分裂一次，染色體的端粒會(huì)縮短，這可能作為有絲分裂的一種時(shí)鐘，表明細(xì)胞年齡、復(fù)制衰老或細(xì)胞凋亡的信號(hào)。研究發(fā)現(xiàn)，90%以上的癌細(xì)胞或凋亡細(xì)胞都具有端粒酶的活

6、性。2）mRNA水平的檢測(cè)研究者們發(fā)現(xiàn)了很多在細(xì)胞凋亡時(shí)表達(dá)異常的基因，檢測(cè)這些特異基因的表達(dá)水平也成為檢測(cè)細(xì)胞凋亡的一種常用方法。據(jù)報(bào)道，F(xiàn)as蛋白結(jié)合受體后能誘導(dǎo)癌細(xì)胞中的細(xì)胞毒性T細(xì)胞（cytotoxicTcells）等靶細(xì)胞。Bcl-2和bcl-X(長(zhǎng)的)作為抗凋亡（bcl-2和bcl-X）的調(diào)節(jié)物，它們的表達(dá)水平比例決定了細(xì)胞是凋亡還是存活。用熒光定量PCR技術(shù)來(lái)檢測(cè)基因表達(dá)水平無(wú)疑比之前者更快更準(zhǔn)確。通過檢測(cè)fas,bax-alpha和bcl-X(長(zhǎng)的)基因的mRNA表達(dá)水平來(lái)進(jìn)行細(xì)胞凋亡的檢測(cè)。

7、5、細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)改變的檢測(cè)：正常狀態(tài)下,谷光苷肽(GSH)作為細(xì)胞的一種重要的氧化還原緩沖劑。細(xì)胞內(nèi)有毒的氧化物通過被GSH還原而定期去除，氧化型的GSH又可被GSH還原酶迅速還原。這一反應(yīng)在線粒體中尤為重要，許多呼吸作用中副產(chǎn)物的氧化損傷將由此被去除。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)GSH的排除非?；钴S時(shí)，細(xì)胞液就由還原環(huán)境轉(zhuǎn)為氧化環(huán)境，這可能導(dǎo)致了凋亡早期細(xì)胞線粒體膜電位的降低，從而使細(xì)胞色素C（三羧酸循環(huán)中的重要組分）從線粒體內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞液中，啟動(dòng)凋亡效應(yīng)器caspase的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。6、細(xì)胞色素C的定位檢測(cè)細(xì)胞色素C作為

8、一種信號(hào)物質(zhì)，在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要的作用。正常情況下，它存在于線粒體內(nèi)膜和外膜之間的腔中，凋亡信號(hào)刺激使其從線粒體釋放至細(xì)胞漿，結(jié)合Apaf-1（apoptoticproteaseactivatingfactor-1）后啟動(dòng)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)：細(xì)胞色素C/Apaf-1復(fù)合物激活caspase-9，后者再激活caspase-3和其它下游caspase。7、線粒體膜電位變化的檢測(cè)：1）線粒體跨膜電